Purificazione e aggregazione della proteina precursore dell'amiloide dominio intracellulare

Lo scopo di questa procedura è purificare il dominio intracellulare della proteina precursore dell'amiloide, noto anche come A ICD, e presentare un protocollo per l'aggregazione termica e la caratterizzazione dell'A ICD mediante microscopia a forza atomica. Questo viene ottenuto esprimendo innanzitutto una fusione A GST dell'A ICD in batteri. Successivamente, la proteina G-S-T-A-I-C-D viene purificata, scissa con trombina per separare il GST dall'A ICD e il GST viene rimosso.

Successivamente, viene indotta l'aggregazione termica dell'A ICD. Infine, gli aggregati di A ICD vengono visualizzati mediante microscopia a forza atomica. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come l'A ICD possa essere purificato fino all'omogeneità in quantità sufficiente per analisi biochimiche e biophysiche.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che richiedono complesse fasi di cromatografia, è che un ICD altamente puro e solubile può essere isolato direttamente sul banco di laboratorio utilizzando reagenti ed attrezzature standard. Un ICD prodotto con questo protocollo è adatto a ulteriori caratterizzazioni biochimiche e biofisiche.

La procedura sarà dimostrata da Amina ti. Il dottor Andres Oberer, già postdottorando del mio laboratorio, mostrerà come eseguire l'immagine al microscopio a forza atomica dell'A ICD. Per esprimere il dominio intracellulare ricombinante di A PP, o A ICD, iniziare con cellule BL 21 trasformate con il vettore pgx 41, contenente l'A ICD umano fuso al termine C del GST. Inoculare una singola colonia in 10 millilitri di brodo LB contenente ampicillina e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione vigorosa. Il mattino seguente.

Incubare 400 millilitri di LB ampicillina in un matraccio da un litro con cinque millilitri della coltura notturna. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione vigorosa fino a quando la densità ottica a 600 nanometri avrà raggiunto un valore compreso tra 0,4 e 0,6. Questo richiederà normalmente da due a 2,5 ore per indurre l'espressione di G-S-T-A-I-C-D.

Aggiungiamo 0,4 millimolari di IPTG e incubiamo a 37 gradi Celsius con agitazione vigorosa per cinque ore. Centrifugare le cellule a 6.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver preparato il buffer di lisi e messo i batteri sul ghiaccio, aggiungere 20 millilitri di buffer al pellet e, utilizzando una combinazione di vortex e ripetuti passaggi sul ghiaccio con una pipetta, sospenderlo completamente.

Resuspendere il pellet batterico; passare il lisato batterico sospeso di Reese attraverso un emulsionatore preraffreddato o una pressa francese. A 30.000 PSI, far passare il lisato attraverso l'emulsionatore una seconda volta e raccoglierlo in un tubo da 50 millilitri preraffreddato. Centrifugare il lisato a 15.000 ×g e a 4 °C per 30 minuti.

Separare e trasferire il sopernatante in un tubo da 50 millilitri preraffreddato. Aggiungere 500 microlitri di una sospensione al 50% di glutathione agarosio. Ruotare per 30 minuti a quattro gradi Celsius mentre il campione è in rotazione.

Preparare un buffer di eluizione fresco dopo l'incubazione. Versare il lisato e la sospensione in una colonna cromatografica monouso in polistirene da cinque pollici con filtri grossolani. Lavare la colonna cinque volte con tre millilitri di PBS.

Chiudere il fondo della colonna e aggiungere 500 microlitri di tampone di eluizione a temperatura ambiente. Chiudere la parte superiore della colonna e ruotare per cinque minuti a temperatura ambiente. Raccogliere l'eluito iniziale in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri raffreddata.

Ripetere l'eluzione altre due volte. Dializzare l'eluito in una membrana dialitica con cutoff di peso molecolare di 10.000 in quattro litri di PBS per tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Dializzare contro altri quattro litri di PBS a quattro gradi Celsius per un'ora.

Rimuovere la proteina dalla cassetta di dialisi ed eseguire un saggio di quantificazione proteica per determinare il rendimento di G-S-T-A-I-C-D. Una purificazione tipica a partire da 400 millilitri di coltura porterà a un rendimento superiore a 20 milligrammi di proteina purificata, con concentrazioni comprese tra 10 e 20 milligrammi per millilitro. Aliquotare la proteina in aliquote da 200 microlitri e congelare a meno 80 gradi Celsius.

Per liberare l'A ICD dal GST thaw, aggiungere 200 microlitri di G-S-T-A-I-C-D purificato e 20 microlitri di trombina ad un'unità per microlitro, quindi incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, rimuovere qualsiasi materiale aggregato mediante centrifugazione a 20.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il sopernatante in una microprovetta preraffreddata per rimuovere GST e trombina. Aggiungere rispettivamente 50 microlitri di sospensione al 50% di glutathione agarosio e 50 microlitri di sospensione al 50% di protein A agarosio.

Incubare in rotazione per cinque minuti a temperatura ambiente. Centrifugare brevemente per sedimentare i granuli di agaro e rimuovere il sopranatante in una provetta pulita. Estrarre la GST altre quattro volte con glutathione.

Aros esegue un saggio di quantificazione proteica su cinque microlitri dell'A ICD purificata. I rendimenti tipici ottenuti da una coltura di 400 millilitri sono compresi tra 50 e 100 microgrammi, con una concentrazione di 0,2-0,5 milligrammi per millilitro. Dopo aver diluito l'A ICD appena preparata in PBS fino a una concentrazione di 0,1 milligrammo per millilitro, si induce l'aggregazione termica incubando i campioni a 43 gradi Celsius a 800 giri al minuto in uno shaker riscaldato per 48 ore.

Diluire il campione di 20 volte con acqua deionizzata e depositare due microlitri su mica appena scollata. Essiccare il campione in un essiccatore per tutta la notte per visualizzare l'A ICD aggregato mediante microscopia a forza atomica in modalità tapping, utilizzando cantilever in nitruro di silicio microappuntiti rivestiti in oro con un raggio della punta nominale di due nanometri.

Amplificazioni tipiche di oscillazione durante l'acquisizione delle immagini, da 10 a 20 nanometri alla frequenza di risonanza delle leve. Qui viene mostrata l'espressione e l'arricchimento relativo di G-S-T-A-I-C-D. Dopo la lisi, la maggior parte della proteina fusa è presente nella frazione solubile e pertanto non è richiesta l'estrazione dai corpi di inclusione.

Il materiale eluito dalla colonna di glutathione è puro al 95%. Nella preparazione qui mostrata, la concentrazione della proteina eluita dalla colonna era di 14,5 milligrammi per millilitro e il rendimento era di 22 milligrammi. La scissione di 200 microlitri di questa preparazione, eseguita durante la notte con 20 unità di trombina, ha determinato una scissione quasi completa (quasi 100%) della proteina di fusione.

La quantità di trombina utilizzata è così bassa da non essere rilevabile mediante kumasi. La colorazione blu e la rimozione della trombina e della GST hanno comportato una certa perdita di materiale. Tuttavia, la purezza era superiore al 90%, con un rendimento in questa preparazione di 70 microgrammi di A ICD a una concentrazione di 0,35 milligrammi per millilitro.

Gli aggregati di ICD, visualizzati mediante microscopia a fluorescenza (FM), sono tipicamente amorfi e di natura steroidea, con dimensioni comprese tra 50 e 100 nanometri. Il materiale aggregato non è rilevabile quando viene aggiunta una quantità equimolare della chaperonina UBI Quillin uno alla reazione di aggregazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come purificare l'EICD, indurne l'aggregazione e visualizzare gli aggregati mediante A-F-M-E-I-C-D.

Il prodotto purificato con questa tecnica può essere utilizzato in altri metodi, come i saggi di scattering della luce e i saggi di filtrazione, per indagare l'effetto delle chaperoni molecolari sull'aggregazione di EACD.