Eterotipica tridimensionale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è generare modelli tridimensionali tipici dello sviluppo del cancro ovarico in fase iniziale. In primo luogo, generare linee cellulari immortalizzate H turt derivate da tessuti primari normali di epitelio ovarico e fibroblasti. Successivamente, per ricreare l'architettura in vivo e le complesse interazioni cellula-cellula presenti nell'ovaio, coltivare in co-coltura linee cellulari epiteliali e stromali in modelli sferoidi tridimensionali, quindi procedere alla fissazione e alla colorazione delle colture organoidi e analizzare l'espressione di marcatori specifici al fine di studiare le caratteristiche molecolari delle interazioni stroma-epiteliali.

I risultati ottenuti mostrano come le alterazioni nel compartimento delle cellule stromali di modelli tridimensionali typic possano influenzare il fenotipo delle cellule epiteliali coltivate in co-coltura. I modelli tridimensionali typic possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro ovarico, come esplorare le origini di questa malattia e chiarire il ruolo del microambiente stromale nell'insorgenza e nello sviluppo tumorale. Le applicazioni di queste tecniche si estendono alla diagnosi e alla terapia delle malattie, rispetto ad altri metodi di coltura tridimensionale.

Questa tecnica può essere applicata a un'ampia gamma di volumi di colture cellulari e di applicazioni a valle. Ad esempio, le colture tridimensionali omogenee e tipiche possono essere utilizzate per test farmacologici in vitro. Questo approccio può essere applicato anche ad altri sistemi modello, come nello studio di altri tipi di tumori solidi o nelle malattie benigne.

Trasportare il tessuto ovarico fresco al laboratorio di coltura cellulare in un mezzo di crescita per fibroblasti ovarici normali immortalizzati, integrato con antibiotici e antics aggiuntivi. Lavare il campione tre volte con cinque millilitri di PBS per rimuovere eventuali cellule epiteliali ancora debolmente aderenti al tessuto. Successivamente, trasferire il campione insieme al PBS in una nuova piastra da coltura P 100. Utilizzando strumenti sterili, trasferire il tessuto in una seconda piastra da coltura P 100 asciutta e pulita.

Tagliare il tessuto in pezzi di 0,5 centimetri quadrati e trasferire ciascun pezzo in una piastra P 100 separata. Continuare a tagliare il tessuto in pezzi di dimensioni inferiori a un millimetro quadrato. Quindi aggiungere 20 millilitri di mezzo INOF GM e coltivare, monitorando la crescita cellulare mediante microscopia a contrasto di fase.

Verificare che le cellule aderiscano alla piastra entro 24 ore. Monitorare la crescita cellulare mediante microscopia a contrasto di fase. Le cellule di solito aderiscono alla piastra entro 24 ore. Dopo una settimana, rimuovere qualsiasi tessuto non aderente mediante aspirazione, rinnovare il terreno e successivamente rifornire le colture due volte alla settimana nell'arco di una a tre settimane, quando le colonie cellulari raggiungono una dimensione di circa 500 micron.

Isolare le colonie utilizzando tripliche e dischetti di clonazione rivestiti. Per confermare la presenza di cellule fibroblastiche al 100%, piastrare un campione della linea cellulare su coprioggetti di vetro ed eseguire una colorazione immunofluorescente per un marcatore fibroblastico, un marcatore epiteliale e un marcatore delle cellule endoteliali.

Un giorno prima della trasduzione retrovirale del passaggio H Turt, isolare le cellule dei fibroblasti ovarici normali da una singola piastra P 100 in tre piastre P 100. Il supernatante virale preformato può essere acquistato oppure prodotto in laboratorio utilizzando protocolli standard di cotrasfezione delle cellule HEC 2 9 3 T. Per preparare la soluzione di poli-Hema, pesare 1,5 grammi di poli-Hema e collocarli in un flacone sterile.

Aggiungere 95 millilitri di etanolo assoluto di grado per biologia molecolare e 5 millilitri di acqua distillata di grado per colture cellulari. Collocare la soluzione di poli-HEMA in un bagnomaria a 65 gradi Celsius fino a completa dissoluzione. Rivestire le piastre per colture cellulari con la soluzione di poli-HEMA appena preparata.

Fare asciugare all'aria le piastre per colture cellulari all'interno della cappa a flusso laminare. Un movimento delicato di oscillazione su una piattaforma oscillante può essere utilizzato per garantire un rivestimento uniforme di piastre o fiasche di dimensioni maggiori. Se la soluzione di poli-L-ornitina si asciuga troppo rapidamente, la superficie non sarà liscia.

Se desiderato, pretrattare i fibroblasti prima della coltura tridimensionale; ad esempio, per indurre la senescenza, pretrattare le cellule con dosi sub-letali di perossido di idrogeno. Recuperare ed espandere in vitro le colture di INOF e di cellule epiteliali per ottenere un numero sufficiente di cellule necessarie per stabilire steroidi eterotopici tridimensionali. Dopo un lavaggio con PBS di cinque minuti, aggiungere 15 millilitri di mezzo alla piastra in poli-hema.

Nel frattempo, aggiungere la tripsina alle cellule di fibroblasti ovarici normali immortalizzate per staccarle dalla piastra di coltura. Dopo tre-cinque minuti, neutralizzare la tripsina con un volume equivalente di mezzo di coltura e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo e mescolare accuratamente aspirando e dispensando con una pipetta o vortexando delicatamente.

Quindi, utilizzare un campione di 10 microlitri per enumerare le cellule vitali mediante trian blue. Aggiungere ora 4 milioni di cellule INOF al mezzo già dispensato nella piastra rivestita con poli-hema. Portare il volume del mezzo di coltura a 20 millilitri e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.

Monitorare l'aggregazione cellulare in steroidi multiceellulari mediante microscopia a contrasto di fase per rialimentare le colture di sferoidi S ogni due o tre giorni. Appoggiare le piastre in posizione inclinata su una pipetta. Lasciare sedimentare gli sferoidi e rimuovere con attenzione circa 16 millilitri di mezzo esausto con una pipetta da cinque millilitri.

Aggiungere 16 millilitri di mezzo fresco alla coltura e reinserire nell'incubatore al giorno sette. Creare colture eterotipiche aggiungendo cellule epiteliali ai fibroblasti phe. Preparare innanzitutto sospensioni di cellule epiteliali ovariche mediante tripsina come descritto in precedenza, dopo aver enumerato le cellule.

Lavare una volta con mezzo INOF GM per evitare che fattori di crescita vengano trasferiti dai mezzi di crescita epiteliali. Dopo aver rinnovato il mezzo delle colture di fibroblasti OID, aggiungere le cellule epiteliali in un rapporto di quattro a uno tra fibroblasti e cellule epiteliali. Le colture di OID eterotopici in INOF GM richiedono il rinnovo del mezzo ogni due o tre giorni per ulteriori 14 giorni.

Per l'immunohistochimica, fissare il PHE con formalina neutra tampone, centrifugare il PHE e sostituire la formalina con etanolo al 70%. Procedere quindi con l'inclusione in paraffina seguendo protocolli standard utilizzati per tessuti umani. I preparati inclusi in paraffina possono essere sezionati e colorati con ematossilina ed eosina o con marcatori molecolari specifici mediante immunohistochimica.

In alternativa, lavare i follicoli in PBS e fissarli in paraformaldeide al 4%. Quindi incorporare i campioni in mezzo OCT e congelarli rapidamente per la sezione al criostato e la colorazione immunofluorescente per l'analisi mediante citometria a flusso. Lavare i follicoli in PBS e dissociarli mediante digestione con tripsina o Accutase a 37 gradi Celsius.

La dissociazione completa di steroidi in una sospensione di singole cellule può essere favorita aspirando e dispensando la soluzione su e giù con una punta da pipetta da un millilitro. Prestare attenzione a non danneggiare eccessivamente le cellule. Neutralizzare la reazione con un volume equivalente di mezzo di coltura e rimuovere gli aggregati cellulari facendo passare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 a 70 micron. Successivamente, centrifugare le cellule per formare un pellet, lavarle con PBS, enumerarle e risospendere il numero desiderato di cellule nel buffer facts, quindi colorarle seguendo le istruzioni del produttore. Nel nostro laboratorio, abbiamo parzialmente trasformato cellule epiteliali ovariche e le abbiamo coltivate in co-coltura con fibroblasti ovarici normali e senescenti per simulare lo sviluppo del cancro ovarico in fase iniziale.

In un ovaio premenopausale, la colorazione immunofluorescente di fibroblasti ovarici normali immortalizzati h hert mostra che sia i fibroblasti ovarici normali primari sia quelli immortalizzati esprimono la proteina specifica dei fibroblasti, ma non esprimono la citocheratina sette ed esprimono menton. Le cellule di fibroblasti ovarici normali coltivate da sole in 3D su PHE mostrano una morfologia fusiforme e una matrice extracellulare abbondante. In questo caso, i fibroblasti ovarici normali sono stati esposti a perossido di idrogeno per indurre senescenza per sette giorni e successivamente coltivati con cellule epiteliali ovariche parzialmente trasformate per 14 giorni.

Per distinguere i due tipi cellulari, i corticosteroidi risultanti sono stati immunoistochimicamente marcati per mim-1 come marcatore di proliferazione e per pan-citocheratina come marcatore epiteliale. La quantificazione dei dati suggerisce che il microambiente senescente promuove caratteristiche neoplastiche di cellule epiteliali parzialmente trasformate, mentre un microambiente normale inibisce la progressione neoplastica; caratteristiche istologiche di cellule normali e maligne, non rilevabili quando le cellule sono coltivate come monocapato, vengono ripristinate. Quando le cellule vengono passate a colture sferoidali, ad esempio, le caratteristiche istologiche dei carcinomi ovarici a cellule chiare possono essere rilevate in colture tridimensionali di linee cellulari di carcinoma ovarico a cellule chiare, ma non in colture in monocapato delle stesse cellule.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come allestire colture tridimensionali tipiche per studiare le interazioni tra cellule epiteliali e stromali durante le fasi iniziali della tumorigenesi. Quando si allestisce una coltura 3D, è importante regolare il numero di cellule in base all'applicazione successiva, prevedendo una certa perdita di materiale durante le lavorazioni.

Una volta padroneggiata, la coltura 3D può essere allestita in un'ora seguendo questa procedura. Altri metodi, come la citometria a flusso abbinata al profilo dell'espressione genica mediante microray, possono essere eseguiti per analizzare le variazioni globali dell'espressione genica che si verificano nelle colture tipiche 3D ma non vengono rilevate in condizioni di coltura in monocstrato. Questo permetterà di analizzare i percorsi di segnalazione bidirezionali che avvengono specificamente in un microambiente di coltura 3D.