Modelli per MAME 4D Live-Imaging cellule di tumore: Interazioni microambiente che Impact progressione maligna

L'obiettivo generale di questa procedura è costruire modelli di co-coltura tridimensionali denominati ingegneria dell'architettura e del microambiente mammario, o MAM, per l'uso nell'immagine in tempo reale di interazioni tra cellule vive. Questo viene realizzato innanzitutto ricoprendo le lamelle con un collagene di tipo uno D quenched, o DQ collagene di tipo uno. Matrice di collagene di tipo uno.

Successivamente, collagene DQ inattivato. Quattro. Sopra il collagene DQ solidificato viene aggiunta una matrice di membrana basale ricostruita, una matrice di collagene di tipo I con fibroblasti inclusi. Nel terzo passaggio, una sospensione di cellule epiteliali o tumorali viene stratificata sopra i coverslip, consentendo alle cellule di aderire al collagene DQ, alla matrice di membrana basale ricostruita, quindi viene aggiunto il mezzo di coltura.

Infine, la microscopia confocale viene utilizzata per eseguire l'imaging in quattro dimensioni, che analizza un'immagine in tre dimensioni spaziali più il tempo delle colture cellulari vive di mamme. In definitiva, l'imaging in quattro dimensioni permette la visualizzazione e l'analisi dell'interazione dinamica tra le cellule tumorali del seno e altre cellule del microambiente tumorale che potrebbero influenzare la progressione verso un fenotipo invasivo. Un vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'imaging intravitale, è che le interazioni osservate nel nostro modello avvengono tra cellule di una singola specie, ovvero cellule tumorali umane e cellule associate al tumore umano, piuttosto che, ad esempio, tra cellule tumorali umane e cellule stromali di topo.

Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché l'assemblaggio delle colture principali richiede innanzitutto di essere visualizzato e poi necessita di competenze moderate e di pratica per avere successo. Iniziare posizionando un coperchio rettangolare in plastica sterilizzato con alcol. Inserire in una piastra di coltura da 35 millimetri oppure utilizzare una piastra IBI tree da 35 millimetri mu.

Quindi mescolare il numero desiderato di fibroblasti con collagene DQ. Successivamente, utilizzando una micropipetta da 100 microlitri, pipettare e distribuire con attenzione 70 microlitri di matrice di collagene DQ con fibroblasti su tutta la superficie del coverslip e posizionare la piastra di coltura nell'incubatore umidificato a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 30 minuti. Dopo che le matrici si sono solidificate, lasciare equilibrare per 10 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.

Quindi posizionare la piastra sotto una cappa fino a quando non raggiunge la temperatura ambiente. Aggiungere 60 microlitri di collagene DQ, quattro matrice di membrana basale riottenuta sulla parte superiore del collagene DQ solidificato, uno, matrice di collagene uno con fibroblasti incorporati. Quindi, utilizzando la punta di una pipetta, distribuire con attenzione il collagene DQ, quattro matrice di membrana basale riottenuta in modo uniforme, evitando di graffiare i fibroblasti nel collagene DQ uno, matrice di collagene uno.

Quindi trasferire la piastra e il coverslip nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 10 minuti, mentre la matrice della membrana basale ricostruita al collagene DQ si solidifica. Dopo aver eseguito la tripsinizzazione, contare le cellule per la coltura co. Ora aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare sul coverslip rivestito e posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 40-60 minuti, in modo da permettere alle cellule di aderire al collagene DQ. Dopo che le cellule si sono attaccate alla matrice, ricostruire una membrana basale: aggiungere 2 millilitri di mezzo di coltura contenente 2% di membrana basale ricostruita alla piastra da 35 millimetri.

Quindi incubare per il periodo di tempo desiderato prima dell'acquisizione delle immagini dopo il lavaggio con PBS; incubare le colture co-colturali con cinque micromoli di Cell Tracker Orange in mezzo MEGM in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 45 minuti. Dopo l'incubazione, lavare nuovamente le colture co-colturali con PBS e incubarle con mezzo MEGM preriscaldato per 30 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Acquisire le immagini delle colture co-colturali in vivo a basso ingrandimento, ad esempio a 10x con un obiettivo ad immersione in acqua su un microscopio confocale, catturando sezioni ottiche a intervalli di 10 micron per tutta la profondità delle strutture.

Utilizzare le sezioni ottiche per ricostruire le immagini in 3D mediante software di velocità o un programma simile. Creare filmati delle ricostruzioni tridimensionali in modo da poter visualizzare le strutture, le interazioni tra cellula e cellula e le interazioni con la matrice circostante. In questo schema rappresentativo di una coltura co-coltivata, una piastra IBI treat mu è stata prima rivestita con collagene, una contenente collagene DQ, e una con fibroblasti, come mostrato in magenta.

Quindi è stato aggiunto un secondo strato di membrana basale ricostruita contenente collagene quattro DQ. Successivamente, le cellule tumorali in rosso sono state seminate in superficie con il 2% di membrana basale ricostruita. In coltura.

I mezzi rappresentati dai puntini di colore crema sono stati aggiunti ogni volta che si è effettuato un cambio di mezzo. I prodotti fluorescenti di scissione del collagene DQ uno e quattro sono rappresentati in verde. Durante i 23 giorni di questo coltura co-coltura rappresentativa MCF 10 DCIS e WS 12 TI, si è verificata una proliferazione delle cellule immortalate qui e nelle figure seguenti, in rosso, nonché una degradazione del collagene DQ quattro e uno osservata qui e nelle figure seguenti, in verde, e delle matrici di collagene, indicata dalla riduzione del volume delle co-colture.

Gli stessi co-coltivi vivi sono stati osservati per 23 giorni, con immagini acquisite mediante microscopia confocale ai giorni tre, 16 e 23 del co-coltivo. Le interazioni nei co-coltivi Mame sono dinamiche e possono cambiare nel tempo. Ad esempio, come si osserva in questo modello 3D del co-coltivo cellulare al giorno tre, le cellule stanno appena iniziando a proliferare nelle matrici in questo momento, ancora piuttosto stabili, come dimostrato dall'assenza di fluorescenza verde.

Tuttavia, al giorno 16, mentre le cellule hanno continuato a proliferare, hanno anche iniziato a degradare la struttura della matrice, come osservato qui attraverso i prodotti di scissione del collagene DQ uno e quattro in verde, e attraverso l'attiva degradazione della matrice da parte delle cellule, dove la matrice e le cellule co-fluorescono, mostrando un segnale giallo. Al giorno 23, quasi la metà della matrice è stata degradata dalle cellule in rapida proliferazione, rispetto al giorno tre, quando il volume della coltura co-colturale era di 110.000 micrometri cubi. Dal giorno 16 al giorno 23, il volume si è ridotto a soli 46.250 micrometri cubi in questo giorno.

16 coltura mista, la proteolisi del collagene DQ quattro sulla superficie delle cellule DCIS in rosso e la proteolisi diffusa del collagene DQ, uno nelle aree vicine ai fibroblasti in bianco, possono essere osservate. La colorazione differenziale utilizzata in questa coltura mista permette inoltre di osservare i distinti modelli di migrazione e proliferazione dei due tipi cellulari dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro al seno per esplorare gli effetti del macroambiente tumorale sulla progressione del cancro, consentendo l'analisi in tempo reale delle interazioni dinamiche tra cellule tumorali e cellule stromali circostanti.