Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

Questo protocollo descrive la generazione di linee cellulari reporter con la luciferasi e il successivo monitoraggio dei ritmi circadiani autonomi cellulari nell'espressione della bioluminescenza. Innanzitutto, costruire reporter lentivirali per l'espressione della luciferasi e produrre le particelle lentivirali, quindi procedere all'infezione delle cellule di interesse e all'amplificazione delle colture selezionate. Successivamente, monitorare l'espressione della bioluminescenza in cellule reporter sincronizzate mediante un dispositivo di registrazione adeguato.

Infine, la registrazione della bioluminescenza viene utilizzata per dimostrare i ritmi circadiani cellulari autonomi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasfezione transitoria e la protezione della linea germinale, è che l'integrazione avviene mediata da VIR. Il gene garantisce un'integrazione stabile nel genoma cellulare, oltre a una maggiore efficienza e versatilità.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sugli orologi circadiani. Ad esempio, esistono orologi circadiani specifici dei tessuti? In caso affermativo, quali sono le proprietà degli orologi circadiani specifici dei tessuti?

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi dell'orologio biologico, può essere applicato anche ad altri sistemi come la dinamica del ciclo cellulare, la tumorigenesi, ecc. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo deciso di studiare orologi biologici specifici per tessuti o tipi cellulari.

La procedura sarà dimostrata dal Dott. Chita Norm Napkin, ricercatore postdottorato, e da Sandra, studentessa laureanda del mio laboratorio Atory. Generalmente, un costrutto reporter del ritmo circadiano nei mammiferi contiene una cassetta di espressione in cui un promotore circadiano è fuso al gene della luciferasi. In questo reporter lentivirale, la luciferasi destabilizzata è sotto il controllo del promotore murino per due.

Per istruzioni dettagliate sulla costruzione di vettori reporter mediante reazione di ricombinazione, consultare il manoscritto allegato per una trasfezione efficiente. Iniziare con una coltura di cellule renali embrionali umane con un numero di passaggi basso e una confluenza compresa tra il 90 e il 100%. Ora procedere al rivestimento di piastre a sei pozzetti.

Per la trasfezione, aggiungere un millilitro di poli-L-lisina allo 0,001% in ciascun pozzetto, incubare a temperatura ambiente per 20 minuti e risciacquare una volta con PBS. Successivamente, raccogliere le cellule utilizzando tripsina e seminare le cellule in ciascun pozzetto delle piastre pre-ricoperte. Agitare delicatamente le piastre per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule.

Verificare che le cellule seminate abbiano raggiunto una confluenza dell'80-90% in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Preparare il mix di trasfezione del plasmide contenente un plasmide reporter lentivirale, DNA e i tre vettori di impacchettamento come controllo sia per la trasfezione che per l'infezione successiva. Includere un ulteriore pozzetto con un vettore lentivirale di espressione GFP che contiene la proteina fluorescente verde migliorata sotto il controllo del promotore CMV.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di cloruro di calcio 0,25 M ai plasmidi e mescolare accuratamente. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione due XBBS e mescolare delicatamente ma accuratamente. Incubare il mix di DNA a temperatura ambiente per 15 minuti.

Nel frattempo, sostituire il mezzo delle cellule 2 9 3 T con due millilitri di mezzo fresco. Rimettere la piastra nell'incubatrice per almeno 10 minuti per permettere l'equilibrazione del pH del mezzo. Successivamente, aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule goccia a goccia, agitare delicatamente la piastra, osservare la formazione di particelle al microscopio e quindi posizionare le cellule in incubazione per tutta la notte.

Circa 16 ore dopo la trasfezione, rinnovare il mezzo con due millilitri di DMEM fresco e coltivare durante la notte. Successivamente, per valutare l'efficienza di trasfezione, analizzare l'espressione di EGFP nelle cellule di controllo della trasfezione. Un'efficienza di trasfezione compresa tra il 90 e il 100% con elevata espressione di EGFP rappresenta un predittore affidabile di una buona preparazione virale.

Raccogliere il mezzo contenente le particelle virali infettive secrete, centrifugare per rimuovere le cellule 293T residue e raccogliere il soprannatante contenente il virus. Al terzo giorno, seminare circa 12.000 cellule 293T in una piastra a 12 pozzetti, coltivarle durante la notte fino a una confluenza del 20-30% e osservare le cellule al quarto giorno. Sempre al quarto giorno, aggiungere polibrene al mezzo raccolto contenente le particelle virali e mescolare accuratamente mediante pipettaggio.

Ora aspirare il mezzo dai tre T tre cellule e aggiungere un millilitro di miscela virale per pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte; dopo aver lavato le cellule una volta con PBS, rinnovare il mezzo e incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte per il recupero e la crescita. Quando confluenti, suddividere le cellule e coltivarle durante la notte il giorno successivo.

Per iniziare la selezione delle cellule infette, aggiungere mezzo fresco contenente 10 microgrammi per millilitro. L'acido blastico da utilizzare deve essere determinato empiricamente per ogni linea cellulare. Rinnovare il mezzo contenente blastina ogni due o tre giorni per la selezione continua delle cellule resistenti all'antibiotico.

Espressione dei reporter dell'orologio biologico. Dopo aver coltivato le cellule resistenti al blastin in piastre da 35 millimetri fino a confluenza, di solito si preparano tre o più piastre per ogni linea cellulare reporter in ciascuna condizione per il fenotipo sarcy. Dopo un lavaggio con PBS, aggiungere DMEM contenente 10 micromolar forline o 200 nanomolar dexamethasone e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per sincronizzare le cellule.

Ora posizionare le cellule in un mezzo di registrazione appena preparato. Coprire le piastre di coltura con coprivetri sterili da 40 millimetri e sigillarli con grasso da vuoto per prevenire l'evaporazione. Caricare le piastre sul luminometro Lumous Cycle e avviare la bioluminescenza in tempo reale.

Registrazione per la registrazione di piastre vecchie da 96 pozzetti. Con il GSR, utilizzare due dispositivi di registrazione come descritto nel manoscritto allegato. È possibile registrare facilmente il ritmo per cinque fino a sette giorni nel programma di analisi del ciclo luminoso.

Prima si esegue l'adattamento della linea di base ai dati grezzi. Successivamente si utilizzano i dati da cui è stata sottratta la linea di base per effettuare l'adattamento a un'onda sinusoidale e determinare i parametri richiesti per i campioni che mostrano ritmi persistenti. Una bontà di adattamento superiore al 90% è facilmente raggiungibile grazie all'elevata luminosità transitoria.

Sensore verso l'alto e cambio del mezzo. Di solito escludiamo il primo ciclo di dati dalla nostra analisi per la presentazione dei dati. Tracciare i dati grezzi in funzione del tempo quando necessario.

Tracciare i dati sottratti alla linea di base per confrontare l'ampiezza e la fase sia nella trasfezione transitoria di cellule 2 9 3 T che nell'infezione di linee cellulari. Le immagini fluorescenti delle cellule trasfettate e transdotte che esprimono GFP indicano che il sistema di trasferimento genico mediato da lentivirus è altamente efficiente. Il ciclo di retroazione principale di un orologio circadiano è costituito da fattori trascrizionali che agiscono sugli elementi enhancer circadiani per produrre un'espressione genica ritmica.

Qui, quattro diversi costrutti reporter in cellule T tre tre producono fasi distinte di espressione del reporter. Fasi intermedie nuove possono essere generate mediante regolazione combinatoria da parte di più elementi circadiani, utilizzando l'abbattimento genico tramite RNAi e composti farmacologicamente attivi. Questo esperimento ha utilizzato il luminometro lum cycle per la registrazione della bioluminescenza delle cellule in piatti da 35 millimetri in cellule U2 OS.

È stato utilizzato un irna per evidenziare gli effetti di silenziamento dei geni cry1 e cry2. Qui, un luminometro a sinergia è stato impiegato per la registrazione della bioluminescenza delle cellule in una piastra a 96 pozzetti contenente cellule reporter T3.

Gli RNA sono stati utilizzati per valutare gli effetti dell'abbattimento tripartito sui ritmi cellulari. In questo esempio, il sistema UX e un luminometro TECAN sono stati utilizzati per la registrazione della bioluminescenza delle cellule in 3 piastre da 84. Mentre vengono selezionate le piastre indicate, piccole molecole possono farmacologicamente bersagliare e alterare la funzione proteica nei ritmi cellulari delle cellule reporter U2 OS.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo della biologia circadiana, permettendo di esplorare i meccanismi dell'orologio biologico e la fisiologia in diversi tipi cellulari e tessutali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare linee cellulari reporter di Lucifer e monitorare i ritmi.

E non dimenticare che lavorare con il VIR può essere estremamente pericoloso, e le precauzioni, come la protezione personale e la decontaminazione virale, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.