Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

L'obiettivo generale degli esperimenti descritti è il monitoraggio dell'integrazione del segnale del potenziale di membrana e dell'elaborazione delle informazioni da parte di una singola cellula nervosa, in modo ottico, con risoluzione submicrometrica e submillisecondi, in diversi punti di un neurone. Questo risultato si ottiene innanzitutto costruendo un sistema di imaging con sensibilità adeguata per consentire la registrazione di piccole variazioni percentuali dell'intensità luminosa corrispondenti al transitorio del potenziale di membrana. Successivamente, si selezionano i neuroni con un'adeguata anatomia per un efficace imaging, dotati di prolungamenti lunghi e integri in un singolo piano focale vicino alla superficie della sezione.

Quindi caricare i neuroni preselezionati con coloranti sensibili al voltaggio per consentire il tracciamento ottico delle variazioni del potenziale di membrana. I risultati mostrano la capacità unica di questo approccio di ottenere informazioni sull'integrazione del segnale elettrico da parte di singole cellule nervose monitorando i segnali del potenziale di membrana provenienti da assoni, dendriti e spine dendritiche. In neurofisiologia cellulare.

Stanno being sviluppati nuovi strumenti a causa dei due limiti di lunga data dell'elettrofisiologia convenzionale: la bassa risoluzione spaziale delle misurazioni mediante elettrodi e l'incapacità di registrare da strutture piccole come collaterali assonici o spine dendritiche. Per superare questi svantaggi, l'approccio con elettrodi a patch può essere combinato con tecniche ottiche che permettono registrazioni parallele da tutte le parti di un neurone. Qui descriviamo una tale tecnica: la registrazione ottica multipla laterale di transitori del potenziale di membrana con risoluzione a livello di singola spina.

In questo esperimento, un microscopio verticale e tre telecamere vengono utilizzati per regolare un'illuminazione uniforme. Inserire innanzitutto un opportuno filtro neutro di densità nel percorso del fascio laser. Successivamente, mettere a fuoco l'obiettivo sulla superficie del vetrino fluorescente standard.

Mentre si osserva l'immagine CCD del campo visivo sullo schermo del monitor, regolare la posizione dell'estremità ricevente della guida luminosa in quarzo e la posizione dell'estremità di uscita della guida luminosa utilizzando gli attuatori appropriati sul condensatore per fluorescenza in episcopia, al fine di ottenere un'illuminazione centrata e uniforme del campo visivo. Per determinare il rumore vibrazionale, utilizzare un vetrino fluorescente standard con un segno non fluorescente sulla superficie. Registrare l'intensità della luce con il CCD neuro in modalità continua.

Mettere a fuoco l'obiettivo su un bordo scuro del segno nero e registrare l'intensità della luce per circa 100 millisecondi a una frequenza di acquisizione di due kilohertz. Quindi visualizzare la media spaziale delle tracce dell'intensità luminosa frazionata provenienti da circa 20 pixel che ricevono luce da un'area uniformemente illuminata e da circa 20 pixel lungo il bordo del segno nero. Il rumore aggiuntivo nella media spaziale proveniente dai pixel con bordi ad alto contrasto riflette il rumore vibratorio del sistema.

È essenziale montare l'otturatore meccanico al di fuori del tavolo di isolamento dalle vibrazioni, in modo che l'apertura dell'otturatore non introduca rumore vibratorio nella registrazione ottica. Questo è un passaggio fondamentale. Montare l'otturatore utilizzando viti in plastica e materiale di isolamento dalle vibrazioni per ridurre il rumore vibratorio acustico che potrebbe essere captato dal sistema di registrazione ottica.

Per isolare le vibrazioni, regolare il tavolo di isolamento dalle vibrazioni fino a quando il rumore di vibrazione dei pixel che coprono il bordo netto dell'immagine è inferiore al rumore di fondo quantico. I cavi dell'equipaggiamento sul tavolo devono essere allentati per evitare di trasmettere vibrazioni meccaniche al microscopio. In questa procedura, preparare sezioni di cervello di spessore compreso tra 300 e 400 micron seguendo procedure standard, utilizzando una linea di topo che esprime EGFP in singole cellule nervose di interesse mediante un sistema confocale a disco rotante.

Visualizzare i neuroni marcati con EGFP nella sezione. Successivamente, selezionare i neuroni con alberi dendritici e assonali integri e con prolungamenti che corrono paralleli e vicini alla superficie della sezione per l'immagine del potenziale di membrana. Quindi riempire una pipetta di patch in vetro dalla punta con soluzione intracellulare priva di colorante fino a due terzi della parte conica dell'elettrodo applicando una pressione negativa per circa 15 secondi.

In seguito, riempire nuovamente l'elettrodo con la soluzione contenente il colorante sensibile alla tensione del potenziale di membrana disciolto nella soluzione intracellulare. A questo punto, effettuare il patch di un neurone precedentemente selezionato entro un minuto dal caricamento del colorante nell'elettrodo. Applicare una bassa pressione positiva, pari a circa 10 millimetri di mercurio, prima che la pipetta venga abbassata nel bagno e durante il posizionamento dell'elettrodo nella sezione; questo garantisce che nessun colorante fuoriesca dall'elettrodo prima che venga stabilito il sigillo.

Aumentare la pressione fino a un valore elevato, di circa 100 millimetri di mercurio, subito prima che l'elettrodo entri in contatto con la superficie della cellula. Per stabilire il sigillo nella configurazione a cellula intera, consentire la diffusione libera del colorante dalla pipetta per il patch somatico al soma per un periodo di 20-45 minuti. Durante la diffusione del colorante, monitorare lo stato fisiologico del neurone registrando i potenziali d'azione evocati in modalità clamp di corrente.

Inoltre, monitorare la quantità di colorazione registrando l'intensità luminosa a riposo dal soma cellulare a una frequenza di acquisizione di due kilohertz e a una frazione dell'intensità luminosa massima regolata mediante filtri neutri. Continuare il processo di scaricamento finché il potenziale d'azione non inizia ad allargarsi. Al termine della colorazione, ritirare con attenzione la pipetta per il patch dal soma in configurazione di clamp di tensione per assicurare che si realizzi la transizione dalla configurazione whole cell a quella outside-out.

Quindi incubare la sezione per ulteriori 1,5-2 ore a temperatura ambiente per consentire al colorante sensibile al voltaggio di diffondersi nei processi neuronali. Dopo che una quantità significativa di colorante si è diffusa lontano dal soma nei processi dendritici e assonici, la forma d'onda del potenziale d'azione dovrebbe essere completamente ripristinata. Nel passaggio successivo, localizzare il soma del neurone colorato mediante fluorescenza a bassa intensità.

Ridurre l'intensità della luce mediante filtri neutri fino al minimo necessario per visualizzare l'oggetto di interesse utilizzando uno stadio XY. Scansionare l'area della sezione contenente il neurone fluorescente finché non viene identificato il soma fluorescente. Posizionare il soma della cellula marcata al centro del campo microscopico. Ricostruire il neurone con un elettrodo standard per patch senza colorante in condizioni DIC. Successivamente, visualizzare i processi neuronali mediante fluorescenza a bassa intensità a una frequenza di acquisizione compresa tra 10 e 40 hertz in modalità di registrazione continua del CCD per l'imaging del potenziale di membrana.

Utilizzando una posizione del palco XY, posizionare il processo neuronale di interesse al centro dell'area di imaging. Inoltre, proteggere il SOMA dalla luce di eccitazione utilizzando l'iride del diaframma del campo parzialmente chiusa del microscopio per ridurre i danni fotodinamici. Successivamente, registrare i segnali ottici relativi ai potenziali d'azione che si propagano all'indietro nei singoli rami dendritici.

Quindi registrare i segnali ottici relativi ai potenziali d'azione nell'assone. Successivamente, registrare i segnali ottici relativi ai potenziali d'azione che si propagano in senso retrogrado nelle spine dendritiche. Utilizzare la frequenza di acquisizione appropriata per una ricostruzione accurata della forma d'onda del segnale.

Nello stesso tempo, mantenere i periodi di registrazione e l'esposizione alla luce di eccitazione ad alta intensità il più brevi possibile per minimizzare lo sbiancamento del colorante e i danni fotodinamici. La registrazione dei segnali ottici è mostrata qui. Il pannello superiore mostra l'immagine confocale ad alta risoluzione di un neurone colorato con il suo assone in posizione di registrazione.

Mentre il pannello centrale mostra l'immagine fluorescente con bassa risoluzione spaziale dell'assone ottenuta mediante CCD, utilizzata per l'immagine del potenziale di membrana, il pannello inferiore presenta le registrazioni elettrodiche dal soma e le registrazioni ottiche dall'AIS e dal nodo di Ranvier. Sono mostrati i dati grezzi e i segnali elaborati. Questa figura mostra i segnali del potenziale d'azione provenienti dall'assone di un neurone corticale di tipo L5 carico con il colorante sensibile al voltaggio Action.

Segnali potenzialmente correlati sono stati registrati a una frequenza di acquisizione di 10 kilohertz. Questi tracciati indicano il transitorio del potenziale d'azione in tre posizioni. Il primo, l'elettrodo che registra dal soma.

Due, le registrazioni ottiche dal cono d'uscita; e tre, la registrazione ottica dal primo nodo di Ranvier; qui sono mostrati i segnali sovrapposti provenienti dalle stesse tre posizioni. Questa figura mostra un burst di quattro potenziali d'azione retrogradi registrati in più punti dell'albero dendritico di un neurone corticale di tipo L5, innescati da brevi impulsi di corrente depolarizzante a 100 hertz. Sono qui mostrati i segnali del potenziale d'azione provenienti da una singola spina dendritica.

Ecco la ricostruzione anatomica ottenuta da una serie di immagini confocali a disco rotante e l'immagine di fluorescenza della stessa regione acquisita con la telecamera CCD. Per l'immagine del potenziale di membrana, nel pannello destro sono mostrati gli andamenti dell'intensità di fluorescenza corrispondenti ai potenziali d'azione che si propagano all'indietro, provenienti dalle posizioni da uno a tre indicate nell'immagine CCD. L'andamento inferiore indica la registrazione dell'elettrodo dal soma.

La preparazione preliminare alla registrazione richiede circa tre ore, compreso il periodo di attesa per la diffusione dei dadi nei processi distali. Il tempo di registrazione è limitato dal normale esaurimento della preparazione e dal danno fotodinamico del PO. L'entità del danno fotodinamico è proporzionale all'intensità della luce di eccitazione, alla durata e al numero delle singole prove di registrazione.

In alcuni esperimenti, è possibile eseguire più di 50 prove di registrazione nell'arco di una o due ore. Altre misurazioni richiedono un'elevata eccitazione, alte intensità luminose e registrazioni più lunghe, ed è limitato dai danni fotodinamici a sole alcune prove di registrazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging del potenziale d'azione da tutta la struttura assonica e terminale di singoli neuroni in sezioni cerebrali.