Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare lo sviluppo timico nei topi mediante citometria a flusso. Questo viene ottenuto preparando sospensioni di singole cellule da timo e milza del topo. Come secondo passaggio, i timociti e le cellule sono marcati con un cocktail di anticorpi per l'identificazione di specifiche popolazioni timiche.

In definitiva, la frequenza e il numero delle diverse popolazioni di linfociti possono essere valutati mediante analisi citofluorimetrica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello sviluppo dei linfociti T, come ad esempio quali geni e vie metaboliche siano importanti per generare un repertorio di cellule T funzionale ma tollerante verso le cellule dell'organismo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo delle cellule T nel timo, può essere applicato anche nello studio dello sviluppo di altre cellule immunitarie.

Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra difficoltà nella progettazione dei propri cocktail anticorpali per la citometria a flusso. Prima di iniziare la dissezione, posizionare una griglia sterile in acciaio inossidabile in una piastra di Petri di 60 per 15 millimetri. Quindi aggiungere cinque millilitri di HBSS alla piastra e conservarla sul ghiaccio per l'isolamento del timo.

Per prima cosa, utilizzare una pinzetta per sollevare l'estremità inferiore dello sterno e visualizzare il diaframma. Successivamente, evitando il fegato, tagliare il diaframma per staccare la gabbia toracica e quindi tagliare la gabbia toracica in senso ascendente su ciascun lato. Facendo attenzione a non danneggiare polmoni e cuore.

Ora utilizzare la pinzetta per tirare delicatamente indietro la gabbia toracica. Il timo è un organo bianco bilobato situato sopra il cuore. Utilizzare il bordo piatto della pinzetta per afferrare la parte inferiore dei lobi.

Quindi estrarre delicatamente il timo e posizionarlo su una delle griglie precedentemente preparate. Per isolare la milza, praticare un'incisione attraverso il peritoneo per esporre la cavità addominale. La milza è un organo di forma allungata e rossa, situato sul lato sinistro della cavità addominale del topo, al di sotto del fegato.

Quindi utilizzare una coppia di pinze per estrarre la milza e un'altra coppia per separare delicatamente il tessuto connettivo. Successivamente, posizionare la milza dissezionata su un’apposita griglia metallica. Ora usare lo stantuffo di una siringa da tre millilitri per macerare ogni organo sulla propria griglia fino a quando rimangono soltanto tessuto connettivo e grasso; quindi pipettare le cellule e l’HBSS in un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi risciacquare ogni filtro con HBS fresco per 3 volte. Successivamente, centrifugare le cellule per cinque minuti a 335 ×g e a 4 gradi Celsius. Dopo aver aspirato il soprannatante, sospendere le cellule in 500 microlitri di un buffer di lisi CK per 10 minuti a temperatura ambiente, mentre i globuli rossi splenici vengono lisati.

Sospendere i timociti a 20 × 10⁶ cellule/mL in tampone FAX e porre in ghiaccio. Aggiungere ora 5 mL di HBSS per ripristinare l'isotonicità dopo la centrifugazione; quindi risospendere il pellet privo di globuli rossi a 20 × 10⁶ cellule/mL in tampone FAX. Iniziare questo passaggio con Ali Watting.

Quattro volte 10 alla sesta dei TIMOCITI riservati per campione di citometria a flusso in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere cellule nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti per i controlli di compensazione. Quindi bloccare i recettori FC in ciascun campione cellulare mediante incubazione con anti CD 1632 per 10 minuti sul ghiaccio.

Ora centrifugare la piastra e quindi rimuovere il liquido dalle pozzette rovesciando la piastra una volta verso il basso in un lavandino; successivamente risospendere ogni pozzetta in 200 microlitri di buffer fax e ripetere il lavaggio. Successivamente, incubare i campioni sperimentali con 200 microlitri di cocktail di anticorpi o con singoli anticorpi coniugati a fluorocromo per i controlli di compensazione. Tutto in buffer fax, su ghiaccio e al buio.

Dopo 30 minuti, lavare le cellule due volte con tampone fax, quindi, dopo aver risospeso le cellule in tampone fax, trasferire i campioni in provette fax in modelli fisiologici transgenici per il TCR e in topi di tipo selvatico. La selezione positiva inizia allo stadio doppio positivo brillante, prima di passare allo stadio doppio positivo opaco. Dopo l'incontro con l'antigene, i timociti doppio positivi opachi entrano quindi in uno stadio transitorio CD4 positivo CD8 basso, prima di diventare CD4.

I timociti singoli positivi per CD8 o i timociti maturi singoli positivi sono caratterizzati dall'elevata espressione del TCR e dalla perdita di CD24. Mentre il profilo CD8 rispetto a CD4 può rivelare difetti nella selezione positiva, l'analisi di TCR beta in funzione di CD69 o CD5 può fornire ulteriori informazioni sulla localizzazione del difetto. Sia CD69 che CD5 vengono infatti upregolati dopo la stimolazione del TCR, con interazioni più forti che inducono un'espressione maggiore di questi marcatori.

In questo grafico TCR beta rispetto a CD69 in un topo wild type, il compartimento TCR beta low CD69 negativo rappresenta una popolazione di timociti doppi positivi pre-selezione. Mentre il compartimento TCR beta intermedio CD69 positivo rappresenta una popolazione transitoria immediatamente successiva all'interazione del TCR e comprende cellule doppi positivi brillanti, alcune doppi positivi deboli e cellule CD4 positivo CD8 basso. Qui, il compartimento TCR beta alto CD69 positivo illustra la popolazione cellulare immediatamente successiva alla selezione positiva, costituita da cellule doppi positivi deboli, CD4 positivo, CD8 basso e cellule singoli positivi per CD4.

Infine, questo profilo con TCR beta alta e CD69 negativo mostra una popolazione cellulare più matura, costituita principalmente da cellule singole positive per CD4 e CD8. L'assenza delle popolazioni con TCR beta intermedia CD69 positivo e TCR beta alta CD69 positivo può indicare un alterato processo di selezione positiva. Variazioni nel rapporto tra cellule singole positive per CD4 e singole positive per CD8 all'interno della popolazione TCR beta alta CD69 negativa possono suggerire alterazioni nell'impegno di linea.

La perdita delle popolazioni TCR beta alta CD69 positiva e TCR beta alta CD69 negativa potrebbe riflettere problemi di sopravvivenza successivi alla selezione positiva. L'analisi del TCR beta mediante CD5 è un'altra strategia per identificare popolazioni pre e post selezione positiva. Queste prime due popolazioni consistono principalmente in timociti doppi positivi brillanti.

La popolazione con TCR beta basso e CD5 basso rappresenta i timociti doppi positivi pre-selezione, mentre la popolazione con TCR beta intermedio e CD5 intermedio è composta dalle cellule che avviano la selezione positiva. Un'alterata generazione di questa o della popolazione precedente suggerisce un difetto nella selezione positiva. La popolazione con TCR beta intermedio e CD5 alto, tuttavia, rappresenta i timociti in corso di selezione positiva e consiste principalmente di doppi positivi deboli e CD4 positivi.

Timociti CD8 low. La popolazione TCR beta high CD5 high consiste principalmente di timociti post selezione positiva. Timociti singoli positivi: variazioni nel rapporto tra CD4 singolo positivo e CD8.

La presenza di cellule singole positive all'interno di questa popolazione, nonostante popolazioni precedenti normali, può suggerire alterazioni nell'impegno della linea cellulare. Inoltre, l'assenza di questa popolazione può indicare una ridotta sopravvivenza dei timociti dopo la selezione positiva, poiché la selezione negativa comporta l'eliminazione di piccole popolazioni specifiche per l'antigene. I difetti in questo processo sono meglio osservabili utilizzando topi transgenici per il TCR; nei timociti di topi CD4 transgenici per HY, i timociti che esprimono il TCR transgenico H-Y-TCR possono essere rilevati con l'anticorpo monoclonale T3.7.

L'H-Y-T-C-R riconosce l'antigene specifico maschile HY presentato all'interno della molecola MHC di Classe I db. Di conseguenza, nei topi CD4 HY maschi avviene una selezione negativa dei timociti positivi per H-Y-T-C-R, come indicato dalla riduzione del numero di timociti doppi positivi positivi per T3.70 e da una diminuzione ancora più marcata del numero di timociti singoli positivi CD8 positivi per T3.7. Al contrario, nei topi CD4 HY femmine avviene una selezione positiva che porta alla generazione di linfociti T singoli positivi CD8 positivi per T3.7.

Sebbene una riduzione del numero di timociti doppi positivi sia indicativa di una selezione negativa, l'assenza di timociti singoli positivi specifici per l'antigene rappresenta la misura più accurata. Un'ulteriore analisi degli scarsi timociti singoli positivi per T3.70 e CD8 nei topi maschi HY CD4 rivela che la maggior parte sono cellule immature CD24 ad alto livello. Mentre la maggior parte dei timociti singoli positivi per T3.70 e CD8 nei topi femmine HY CD4 ha raggiunto la maturità ed è CD24 a basso livello, fornendo ulteriore supporto all'ipotesi che la selezione negativa avvenga nei topi maschi HY CD4.

Un limite dei modelli transgenici per il TCR è che risulta difficile caratterizzare ulteriormente la selezione positiva identificando popolazioni in base all'espressione di TCR e CD 69 o CD 5, a causa dell'elevata espressione di TCR durante tutto lo sviluppo dei timociti. I topi HY CD 4 femmine presentano una vasta popolazione di timociti doppi positivi T 3,70 positivi che subiscono selezione positiva, come indicato dall'aumento della popolazione positiva per CD 69 rispetto al tipo selvaggio. La selezione negativa comporta uno stimolo del TCR con affinità maggiore rispetto alla selezione positiva. Questo fenomeno è indicato dall'espressione più elevata di CD 69 sui timociti doppi positivi T 3,70 positivi nei topi maschi HY CD 4, con conseguente spostamento verso destra del picco dell'istogramma.

Trend simili si osservano con l'espressione di CD5 nell'analisi della selezione timica in topi geneticamente modificati. L'esame dell'espressione di CD69 o CD5 permette di determinare se il difetto riguardi il segnale proveniente dal TCR o un evento a valle della sua stimolazione. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due ore e mezza per la preparazione e la colorazione delle cellule, più un'ora aggiuntiva per l'acquisizione dei dati al citometro a flusso.

Se eseguito correttamente, ogni topo aggiuntivo richiederà circa 30 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di manipolare i timociti con delicatezza e di aver pianificato in anticipo la strategia di marcatura. Seguire questa procedura.

Altri saggi, come i saggi di uccisione o i saggi di produzione di citochine, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio se i timociti esportati funzionano correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare lo sviluppo del sito timico mediante citometria a flusso.