Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare il sonno definito tramite EEG e la concentrazione di lattato durante una stimolazione optogenetica in precise coordinate stereotassiche. Impiantare chirurgicamente i fili elettroencefalografici necessari e le cannule per un sensore di lattato e un cavo in fibra ottica. Successivamente, inserire il cavo in fibra ottica e il sensore di lattato precalibrato nelle rispettive cannule guida nel cranio dell'animale.

Successivamente, regolare l'intensità dello stimolo di luce blu per ottenere la risposta elettrofisiologica desiderata. Procedere quindi con l'acquisizione dei dati di concentrazione di elettroencefalografia, elettromiografia e lattato mentre l'animale è libero di comportarsi spontaneamente o di dormire. Rispetto ad altri metodi come gli studi farmacologici dell'EEG, questo approccio sperimentale presenta il vantaggio di monitorare la biochimica e l'elettrofisiologia cerebrale mentre l'attività dei neuroni viene manipolata in tempo reale su una scala temporale sub-secondo.

Pertanto, il potenziale di fornire nuove intuizioni nel campo della ricerca sul sonno è elevato. Ad esempio, è possibile identificare i concomitanti metabolici ed elettrofisiologici del sonno a onde lente. Questo tipo di esperimento può essere applicato anche in altre aree delle neuroscienze, come l'apprendimento e la memoria, la plasticità sinaptica o i disturbi epilettici.

La tecnica chirurgica è tecnicamente impegnativa. Richiede una notevole abilità manuale, che tuttavia può essere acquisita con la pratica. In questa dimostrazione visiva, illustrerò i passaggi fondamentali di alcune procedure chirurgiche complesse, che andranno a integrare la descrizione scritta.

Dopo che un animale si è ripreso dall'intervento chirurgico, la sfida consiste nell'inserire correttamente il sensore del lattato e il cavo in fibra ottica. Jonathan e io dimostreremo come utilizzare una presa ferma durante il contenimento dell'animale per inserire questi due strumenti delicati. Infine, mostreremo come ottimizzare la risposta EEG regolando in tempo reale l'intensità dello stimolo.

Per questo esperimento, utilizzare topi transgenici che esprimono il canale cationico sensibile alla luce blu. Il canale si esprime in due tipi di neuroni della corteccia cerebrale. Anestetizzare innanzitutto il topo utilizzando il 5% di isoflurano, 95% di ossigeno per l'induzione, mantenendo l'anestesia con il 3% di isoflurano, 97% di ossigeno.

Eseguire un'incisione mediana sulla parte superiore del cranio, dalla regione tra gli occhi fino alla parte posteriore del cranio. Pulire il cranio con perossido di idrogeno e soluzione salina sterile. Individuare e segnare i punti B e Lambda per determinare le coordinate stereotassiche per le configurazioni dello stimolo ottogenetico dell'elettrodo; praticare i fori pilota con un trapano dentale ad alta velocità dotato di una fresa sferica da 0,5 millimetri, seguita da una fresa sferica da 0,7 millimetri.

Inserire le viti a testa zigrinata nell'elettrodo nei fori utilizzando un cacciavite a taglio. Avvitare di circa quattro-cinque giri per ottenere la profondità desiderata. Tenere ferme le cannule guida con una cannula stereotassica, quindi fissarle al cranio e agli ancoraggi con cemento acrilico. Per mantenere la pervietà, ogni cannula guida deve contenere una cannula finta o un filo guida dal momento dell'intervento chirurgico fino al momento dell'esperimento.

Una volta posizionati gli elettroencefalogrammi (EEG) e le cannule guida nel cranio, fissarli insieme con uno strato sottile di cemento acrilico dentale. Dopo che il cemento si è indurito, posizionare il connettore in plastica sopra il mucchio di cemento secco, collegando le estremità dei fili provenienti dai capi EEG ai contatti sul connettore in plastica, nel caso in cui i fili siano incorporati nel cemento. Successivamente, far passare i fili dell'elettromiogramma attraverso i muscoli nucleari facendoli scivolare all'interno del cilindro di un ago da 21 gauge.

Passare attraverso il muscolo un nodo chirurgo doppio con un filo di nylon cinque zero intorno a questi cavi appena distali rispetto al punto in cui escono dal muscolo; suturare nuovamente insieme la cute che era stata retratta per accedere al tessuto muscolare con punti chirurgici interrotti singoli, utilizzando un ago P3 con taglio inverso e filo di nylon cinque zero. Una volta programmata l'unità di stimolazione mc, farla funzionare come generatore di segnale autonomo con un segnale binario acceso-spento di cinque volt. Collegare l'unità di stimolazione mc all'unità di alimentazione abilitata TTL del laser mediante connettori BNC.

Collegare l'unità di alimentazione del laser al laser tramite un cavo a nastro. Collegare inoltre il laser al connettore FC maschio sul cavo patch in fibra ottica di partenza. Collegare il cavo in fibra ottica di partenza al giunto rotante.

Il giunto rotante in fibra ottica funge da commutatore. Mentre l'animale si muove all'interno della gabbia, il giunto rotante ruota per evitare la rottura dei cavi in fibra ottica a causa della coppia rotazionale. Fissare il commutatore a un supporto metallico posizionato sopra la gabbia cilindrica in cui è alloggiato l'animale utilizzando fascette di plastica.

Trattenere il topo utilizzando una mano per bloccarlo sotto un palmo a coppa. Orientare la testa tra il dito medio e l'indice dell'operatore. Rimuovere ora i detriti dalla cannula guida, utilizzando un ago sterile da 25 gauge.

Inserire quindi il cavo in fibra ottica manualmente e fissarlo alla cannula guida per fibra ottica mediante un tappo filettato. Controllare la profondità di inserzione del cavo in fibra ottica nel cervello tramite un nodo di sutura legato al cavo in fibra ottica a una distanza fissa dall'estremità piana tagliata. Il sensore viene equilibrato in soluzione salina tamponata al fosfato ed esposto a tre concentrazioni di L-lattato in modo progressivo.

Secondo le istruzioni del produttore, inserire il sensore precalibrato nella cannula guida per lattato montata sul cranio, seguendo una procedura identica a quella utilizzata per l'inserimento del cavo in fibra ottica. Collegare il sensore per il lattato al preamplificatore del biosensore Pinnacle 8,400 mediante connettori bipolari. Successivamente, collegare questo preamplificatore al connettore a otto pin montato chirurgicamente sulla testa.

Prima di raccogliere i dati, utilizzare la manopola di regolazione dell'intensità del laser per aggiustare l'intensità dello stimolo optogenetico. L'ampiezza della risposta EEG varierà da animale ad animale a causa di fattori che non sono stati studiati in modo sistematico. È pertanto necessario regolare l'intensità dello stimolo optogenetico e verificare che la risposta EEG sia adeguata una volta raggiunta la risposta desiderata.

Raccogliere i dati utilizzando il sistema Pinnacle 8, 400 con il neuro score. Un'interfaccia SEIA classifica gli stati di sonno mediante ispezione visiva dei dati di EEG e di EMG elaborati. I dati vengono registrati in epoche di dieci secondi come veglia, sonno non REM (movimento oculare rapido) o sonno REM in base all'EEG e all'EMG.

Questa configurazione del biosensore e dello stimolo optogenetico mostra gli elettrodi EEG impiantati chirurgicamente, il sensore di lattato e la cannula per la stimolazione optogenetica. In assenza di stimolazione optogenetica, questo topo ha sperimentato sonno spontaneo. Sono state monitorate continuamente le transizioni tra lo stato di veglia e i due sottotipi di sonno, insieme all'EEG-EMG e alla concentrazione cerebrale di lattato.

I movimenti oculari rapidi e i movimenti oculari non rapidi sono definiti in base all'EEG e all'EMG. Curiosamente, la corrente del biosensore del lattato aumenta in funzione dell'EEG a bassa ampiezza e diminuisce in funzione dell'EEG ad alta ampiezza. Entrambi i canali dell'EEG rispondono a stimoli optogenetici applicati nella corteccia frontale.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impiantare chirurgicamente un topo per effettuare simultaneamente manipolazioni optogenetiche e misurazioni dell'elettroencefalogramma, dell'elettromiogramma e della concentrazione di lattato nel cervello. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica chirurgica può essere eseguita correttamente in 90-120 minuti. Ricorda di monitorare costantemente la respirazione dell'animale come indicatore della profondità dell'anestesia.

Se l'animale respira meno di frequente rispetto a una volta ogni quattro-cinque secondi, l'anestesia potrebbe essere troppo profonda. Se l'animale respira più di frequente rispetto a una volta ogni due secondi, l'anestesia potrebbe essere troppo leggera. Ricordarsi di adottare le opportune precauzioni di sicurezza quando si utilizza l'agente anestetico gassoso isoflurano.

Assicurarsi di avere un'adeguata ventilazione nella sala operatoria per proteggere la retina dal laser utilizzato per la stimolazione optogenetica. Indossare occhiali protettivi oppure racchiudere l'animale in un armadio a prova di luce. È necessario esercitarsi nell'impianto del biosensore del lattato e del cavo in fibra ottica in un topo completamente sveglio.

I topi non sono collaborativi con queste procedure e devono essere immobilizzati. Tuttavia, il contenimento non deve essere così forte da provocare lesioni all'animale o impedirne la respirazione.