L'obiettivo generale di questa procedura è isolare vescicole F1 F zero APAs dal cervello di ratto per eseguire registrazioni mediante tecnica del patch clamp. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il cervello da un ratto ed eseguendo l'omogeneizzazione. Il secondo passaggio consiste nel rompere le zone sinaptiche applicando pressione.

Successivamente, i sinaptosomi vengono stratificati sui gradienti in provetta. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare con digitonina e L per ottenere le vescicole finali da utilizzare per la registrazione mediante patch clamp. Una funzione importante dei mitocondri è la produzione di ATP mediante fosforilazione ossidativa.

L'enzima responsabile della produzione di ATP è l'ATP sintasi localizzata nella membrana interna mitocondriale. Per studiare in dettaglio la funzione dell'ATP sintasi, isoliamo speciali vescicole sub-mitochondriali che chiamiamo SMV. Esse contengono l'enzima ATP sintasi in una configurazione invertita (a testa in giù).

Registriamo quindi queste SMV mediante un elettrodo per la tecnica del patch clamp e determiniamo la permeabilità della loro membrana. Questo ci fornisce informazioni sull'efficienza della produzione di TP da parte dei mitocondri. Sylvia ti, ricercatrice postdottorato nel mio laboratorio presso la Yale University, dimostrerà oggi questa procedura.

In questo procedimento, dopo aver ottenuto la testa di un ratto mediante decapitazione, tagliare la pelle per esporre il cranio, quindi aprire delicatamente il cranio praticandovi un'incisione con un paio di forbici o con le Rons. Successivamente, rimuovere il cervello, tritare il cervello senza il cervelletto finalmente in isolamento, tamponare, quindi trasferirlo in un omogeneizzatore in vetro e teflon da cinque millilitri e omogeneizzare delicatamente il tessuto 10 volte, per circa cinque minuti in totale. Dopodiché, centrifugare il campione a 1.500 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga da banco.

Conservare il soprannatante con i mitocondri e i sinaptosomi e scartare il pellet. Quindi, centrifugare nuovamente a 16.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga da banco. Successivamente, scartare il soprannatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di buffer di isolamento. Rompere i sinaptosomi utilizzando un dispositivo per la rottura cellulare applicando una pressione di 1.200 PSI per 10 minuti, seguita da una rapida decompressione. Applicare quindi le frazioni sinaptiche lisate sui tubi della centrifuga con due diverse concentrazioni di Ficoll che formeranno due strati.

Successivamente, posizionare i tubi in un rotore SW 50.1 e centrifugare a 126.500 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. In un ultracentrifugo, il pellet corrisponde ai mitocondri purificati. Lo strato compreso tra le diverse densità del fial è il sinaptosoma non disturbato.

In seguito, lavare il pellet centrifugando nell'isolamento. Buffer a 16.000 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga da banco. Ora risospendere i mitocondri in 200 microlitri di buffer di isolamento, combinati con un volume uguale di 1% digitonina.

Collocarlo sul ghiaccio per 15 minuti. Successivamente, aggiungere ulteriore tampone di isolamento e centrifugare a 16.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere questa procedura due volte, quindi risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone di isolamento e aggiungere due microlitri di 10% Laemmli buffer, mescolare e collocare sul ghiaccio per 15 minuti.

Dopo di ciò, stratificare la miscela in tampone di isolamento all'interno delle provette per centrifuga. Posizionare le provette in un rotore SSW 50.1 e centrifugare a 182.000 ×g a quattro gradi Celsius per un'ora. Trascorsa un'ora.

Lavare la paletta finale centrifugandola in tampone di isolamento a 16.000 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Un apparato tipico per elettrofisiologia comprende un amplificatore, un computer PC dotato di un'interfaccia digitale 1.440, un convertitore da analogico a digitale in combinazione con il software P clamp 10.0, manipolatori, un microscopio, un tavolo di isolamento dalle vibrazioni e una gabbia di Faraday. Per prima cosa, tirare una pipetta da un capillare in vetro borosilicato utilizzando un tiratore di micropipette Flame/Brown.

La resistenza ottimale della pipetta deve essere compresa tra 80 e 100 mega ohm. Aggiungere le vescicole sub-mitochondriali in una soluzione intracellulare fisiologica. Successivamente, riempire una pipetta per patch clamp con la stessa soluzione.

Visualizzare le vescicole in contrasto di fase. Microscopia dopo che le SMV sono state sigillate a temperatura ambiente. Registrare l'attività quando il potenziale di membrana è mantenuto al voltaggio compreso tra -100 millivolt e +100 millivolt per 10 secondi ogni periodo.

I dati registrati vengono filtrati a cinque kilohertz utilizzando l'elettronica dell'amplificatore e analizzati con il software ClampFit 10.0. Questa figura mostra la macchia di lisato preparata da citosol e mitocondri. Il pannello superiore mostra una immunomacchia utilizzando un anticorpo contro la proteina citosolica GA dh.

Il pannello inferiore mostra una blot utilizzando un anticorpo contro la proteina della membrana interna mitocondriale. Cox quattro Qui sono riportate due registrazioni rappresentative di patch clamp prima e dopo l'aggiunta di un millimolare di ATP. Il potenziale di clamping è di +70 millivolt. La linea tratteggiata rappresenta zero picoampere.

Ogni traccia viene registrata per 10 secondi e vi sono 10 secondi tra una traccia e l'altra. Di seguito sono riportate le tracce di esempio delle variazioni di intensità di fluorescenza dell'indicatore CMA nel tempo in presenza di vescicole mitocondriali (SMVs) e in assenza o presenza di ATP. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della procedura per isolare i mitocondri e delle vescicole sub-mitocondriali contenenti la sintasi F1 FO ATP. Inoltre, si dovrebbe comprendere come formare un sigillo resistente di tipo I con un elettrodo sulla membrana della vescicola al fine di analizzare l'attività del canale del complesso ATP sintasi.