Massa Citometria: Protocollo per l'ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la corretta taratura giornaliera e l'analisi del campione su uno strumento CyTOF. Innanzitutto, lo strumento viene assemblato e acceso. Successivamente, le impostazioni dello strumento vengono ottimizzate per la taratura al segnale massimo.

La macchina è quindi pronta per eseguire i campioni. Nell'ultimo passaggio, la macchina viene pulita e spenta. In definitiva, dati cellulari ottimali possono essere acquisiti in base a specifiche esigenze temporali.

La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale. Le procedure quotidiane di configurazione, taratura e pulizia sono difficili da apprendere dal manuale, poiché comportano diversi passaggi software simultanei.

È necessario acquisire esperienza per sviluppare una sensibilità riguardo ai livelli di fondo e alle intensità del segnale appropriati. Almeno 15 minuti prima di iniziare un esperimento, aprire il programma software CyTOF e selezionare la configurazione dello strumento. Successivamente, nella scheda del vano porta schede, fare clic sul pulsante di accensione del riscaldatore per permettere al mantello della camera di nebulizzazione di raggiungere i 200 gradi Celsius.

Sostituire la siringa nella pompa per siringa con una siringa nuova riempita con acqua milli cube. Quindi pulire il nebulizzatore eseguendo un lavaggio inverso con Citron al 5% due volte attraverso ciascuna porta. Per rimuovere eventuali residui di Citron, ripetere il lavaggio inverso con acqua Milli Q.

Successivamente, aprire la valvola della bombola di gas argon, facendo accendere la spia Argonne sulla parte anteriore della macchina. Quindi collegare il nebulizzatore all'ingresso del gas di compensazione e connettere il nebulizzatore al tubo di introduzione del liquido. Inserire l'estremità del nebulizzatore nell'apertura bianca nel mantello riscaldante nella scheda del controller RFG della finestra di configurazione dello strumento.

Fare clic su avvia plasma, quindi fare clic su ok. Al termine dell'avvio, fare clic nuovamente su ok nella finestra popup. Ora accendere la pompa a siringa.

Quando si ricarica la siringa, premere il pulsante di arresto invece del pulsante di pausa per reimpostare il contatore del volume. Prima di calibrare il citometro di massa, assicurarsi che sia stato acceso per almeno 20 minuti. Una volta che l'apparecchiatura ha raggiunto la stabilità, fare clic sul pulsante delle impostazioni di acquisizione per aprire la finestra delle impostazioni di acquisizione dati. Nella scheda analiti.

Fare clic sulla tavola periodica per aprire il pannello di selezione degli isotopi. Quindi selezionare gli isotopi presenti nella soluzione di taratura DVS Sciences elencati nel manuale e fare clic su Salva. Successivamente, fare clic sul pulsante isotopi per lettura per aprire la finestra delle masse per lettura.

Selezionare il numero di impulsi e ridimensionare l'asse y inserendo un nuovo numero e premendo invio. Riempire ora una siringa verde da un millilitro norm inject con la soluzione di taratura. Ruotare il selettore del portacampioni su load.

Iniettare 450 microlitri di soluzione di taratura, quindi ruotare il selettore su inietta. Attendere finché gli isotopi della soluzione di taratura non iniziano a comparire come strisce in questo display. I segnali nel tempo di volo, nella regione da 9.400 a 9.800, sono dovuti agli isotopi dello xenon presente nel gas argon.

Ora tornare alle masse per la finestra di lettura e fare clic sul pulsante verde di riproduzione. Ogni linea colorata rappresenta gli isotopi selezionati dalla scheda degli analiti. Quando i livelli degli isotopi sono stabili, regolare la corrente selezionando la corrente desiderata dal menu a tendina nella scheda dei parametri della finestra di impostazioni di acquisizione dati.

Nella finestra iniziale, inserire zero per l'arrivo, inserire 10. Per il valore del passo, inserire 0,5 e per il tempo di stabilizzazione, inserire 200. Quindi fare clic su salva.

Quindi fare clic nuovamente sulla finestra delle masse per lettura e premere riproduci. Dopo aver annotato i punti di picco dei segnali degli isotopi, passare alla scheda di configurazione del canale DAC della finestra di impostazione dello strumento. Scorrere verso il basso fino alla voce corrente e inserire il valore del picco dell'isotopo.

Fare clic su "imposta valore corrente effettivo" e quindi salvare. Successivamente, modificare il menu a discesa per selezionare il gas di compensazione. Inserire 0,55 nella finestra di inizio, 0,95 nella finestra di fine, 0,05 nella finestra del valore di passo e 200 nella finestra del tempo di stabilizzazione.

Fare clic su salva. Dopo essere tornati alla finestra delle masse per lettura e aver fatto nuovamente clic su riproduci, l'asse x mostrerà ora la portata del gas di supporto. Prendere nota dei valori in corrispondenza dei quali i segnali degli isotopi raggiungono il picco ed osservare l'aumento rapido del segnale GD 1 55 verso la fine.

Quindi tornare alla scheda di configurazione del canale DAC. Scorrere verso il basso fino a "makeup", "gas", e inserire il nuovo valore del picco isotopico. Fare clic su "imposta valore attuale".

Quindi fare nuovamente clic su salva per registrare il rapporto tra l'isotopo desiderato e l'ossido. Innanzitutto, effettuare un secondo iniezione di 450 microlitri di soluzione di taratura. Successivamente, nella scheda dei parametri, selezionare "tempo" dal menu a tendina e inserire zero nella finestra di inizio, 10 nella finesta di fine, 1 nel campo del valore del passo e 200 nella finestra di stabilizzazione.

Dopo aver fatto clic su play nella finestra delle masse per lettura, utilizzare il cursore per leggere il valore più alto per TM 1 69 o TB 1 59, e anche il valore GD 1 55. Iniettare ora tre millilitri di acqua Milli Q attraverso il loop del campione, seguiti da 500 microlitri di soluzione lavaggio DVS. Nella scheda di calibrazione della massa, fare clic su esegui per monitorare l'andamento del lavaggio di pulizia finché l'intensità delle strisce non inizia a diminuire.

Quindi aggiungere tre millilitri di acqua milliq e monitorare fino a quando le strisce si riducono a livelli di fondo. Iniziare inserendo gli isotopi del campione appena illustrati per gli isotopi della soluzione di taratura, quindi fare clic su salva. Successivamente, aprire la finestra di acquisizione e modificare le impostazioni di acquisizione secondo le esigenze del volume del campione.

Ad esempio, un campione di 450 microlitri riempirà il loop di campionamento e richiederà 600 secondi per l'esecuzione, per consentire ritardi nell'acquisizione dei dati cellulari. Impostare il ritardo di acquisizione su almeno 30 secondi e il ritardo di stabilità del rilevatore su almeno 20 secondi prima dell'esecuzione. Lavare i campioni cellulari almeno due volte con acqua milli cube, quindi risospendere il campione a un massimo di 10 alla sesta cellule per millilitro e filtrare la soluzione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare da 35 micrometri.

Per rimuovere eventuali aggregati. Ora inserire un nuovo nome di file per il campione corrente. Si noti che tutti i file devono essere salvati nel disco E.

Quindi commutare la valvola del loop campione su "load", iniettare il campione, riportare la valvola del loop campione su "inject" e fare clic su "run" nella finestra di acquisizione. Le cellule verranno rappresentate nella finestra di anteprima come serie orizzontali di segni in ciascun canale isotopico verticale e mostreranno la migliore risoluzione intorno a 300-500 cellule al secondo, come illustrato qui.

Al termine dell'acquisizione dati del campione, apparirà una finestra pop-up. Fare clic su OK per confermare il completamento dell'analisi del campione, quindi iniettare almeno 500 microlitri di acqua MQ tra ogni campione per contribuire a minimizzare il carryover del campione e pulire lo strumento. Dopo l'uso, iniettare 450 microlitri di soluzione di lavaggio nel loop del campione. Monitorare il rilascio del metallo libero, quindi lavare il loop del campione con tre millilitri di acqua milli Q, monitorando il lavaggio fino al raggiungimento di livelli di fondo stabili.

Quindi, per spegnere lo strumento, selezionare la scheda del controller RFG nella finestra di configurazione dello strumento e fare clic su "ferma plasma". Al termine della procedura, fare clic su "ok" nella finestra a comparsa, che raccomanda la rimozione del nebulizzatore sotto la scheda del vano alloggiamento. Spegnere il riscaldatore, chiudere la valvola della fornitura di argon e quindi estrarre con attenzione il nebulizzatore tirandolo all'indietro dalla camera di nebulizzazione.

Successivamente, svitare il tubo di introduzione del campione e metterlo da parte. Svitare il collegamento di introduzione del gas di compensazione fino a quando non si allenta leggermente, quindi rimuovere il nebulizzatore. Infine, utilizzando la stessa siringa e lo stesso tubo mostrati in precedenza, pulire entrambi i fori del nebulizzatore con Citron al 5% e conservare il nebulizzatore coperto con Citron al 5% fino all'utilizzo successivo.

Un adeguato lavaggio del citometro a massa con acqua UE e soluzione lavaggio DVS ridurrà i livelli di assorbimento metallico nei tubi e in altre parti della macchina, contribuendo a ridurre qualsiasi fondo, come mostrato in questi grafici. Una taratura non corretta, rappresentata dalla linea magenta, ha aumentato in modo significativo la formazione di ossidi a m più 16 rispetto al campione correttamente tarato, indicato dalla linea blu scuro. Questo comporta una leggera diminuzione dei segnali desiderati a m e un aumento significativo dell'interferenza di fondo indesiderata a m più 16.

Un'adeguata lavaggio e un'appropriata diluizione dei campioni in acqua Milli Q garantiranno un fondo minimo e la massima risoluzione delle cellule, mantenendo un equilibrio con la necessità di velocità. Analogamente ai dati di un esperimento rappresentativo mostrati qui, in questo esperimento, perline di polistirene contenenti lantanio 139 ODIUM 140, TERBIO 159, DIUM 169 e LUTEZIO 175 naturali sono state analizzate in modalità di acquisizione cellulare. I dati sono stati analizzati utilizzando FlowJo ed eventuali detriti derivanti da perline rotte sono stati esclusi tramite gating.

Il campione correttamente tarato è stato determinato alla portata di 0,74 litri al minuto, come rappresentato dalla linea blu scuro. A questa portata si sono osservate intensità del segnale superiori rispetto a quelle alle portate più basse, e si è visto che questo campione correttamente tarato presentava un segnale più intenso alle masse metalliche M e un segnale inferiore alle masse ossidiche m + 16 rispetto ai segnali non correttamente tarati. Qui viene mostrato un ingrandimento del segnale alle masse M LANTANIO 1 39 e TULIO 1 69.

Si noti che la portata del gas di makeup influenza l'intensità del segnale del LANTANIO 139 più di quanto influenzi l'intensità del segnale del tulio 169. Questi grafici mostrano il segnale alle masse ossidiche m + 16, ovvero 155 e 180,5, corrispondenti rispettivamente agli ossidi di LANTANIO 139 + OH 16 e tulio 169 + OH 16. Si osservi che l'aumento della portata del gas di makeup incrementa il segnale della massa 155 molto più di quanto non faccia con il segnale della massa 180,5, poiché il lantanio 139 si ossida più facilmente rispetto al tulio 169.

Le intensità del segnale di massa m e m più 16 in funzione della portata del gas di makeup sono rappresentate qui. Le icone piene rappresentano la massa M, mentre le icone aperte rappresentano la massa M più 16; i colori delle linee corrispondono alla rispettiva massa M. Si noti che le intensità del segnale di LANTANIO 139 e PRASEODIMIO 141 sono fortemente influenzate dalla portata del gas di makeup, arrivando persino a un punto in cui è presente più ossido di massa M più 16 rispetto alla massa M. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come avviare correttamente il CyTOF, tararlo opportunamente, eseguire i propri campioni e infine pulire e spegnere correttamente lo strumento al termine delle analisi giornaliere.