Analisi e costruzione di strutture acidi nucleici con 3DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è mettere a disposizione dei ricercatori di laboratorio e di altri utenti la suite di programmi 3D NA per studiare l'organizzazione spaziale di DNA e RNA mediante strumenti computazionali all'avanguardia. Questo risultato si ottiene innanzitutto scaricando il software dal forum 3D NA e installandolo su un computer locale. Il secondo passaggio consiste nell'analizzare una struttura rappresentativa di DNA a livello dei singoli passi tra coppie di basi.

Successivamente, la stessa struttura del DNA viene modificata a livello di coppia di basi e quindi ricostruita utilizzando i nuovi parametri definiti per il passo della coppia di basi. Il passaggio successivo consiste nell'analisi di un ampio insieme di strutture correlate. L'ultimo passaggio prevede l'allineamento di un insieme di strutture del DNA correlate su un comune sistema di riferimento al fine di visualizzare le distorsioni globali delle strutture.

Infine, gli strumenti 3D NA vengono utilizzati per esaminare in che modo singoli passi delle coppie di basi, compresi quelli legati a farmaci e proteine, contribuiscono al ripiegamento complessivo del DNA e per identificare i siti e le direzioni di distorsioni globali significative. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che il software è robusto e ampiamente applicabile a una varietà di strutture contenenti acidi nucleici. Il metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in biochimica e biofisica, come ad esempio come i genomi sono organizzati in tre dimensioni e quale tipo di deformazione il DNA può assumere.

Per iniziare l'installazione del pacchetto software, collegarsi al sito web di DA three@xthreed.org e fare clic sul collegamento al forum 3D NA all'interno del forum. Selezionare il collegamento di registrazione e seguire le istruzioni per creare un nuovo account.

Dopo aver stabilito un nome utente e una password, accedere al forum, selezionare il collegamento per il download nella sezione di benvenuto e, nella nuova pagina, scegliere il download di 3D NA. Fare doppio clic sul file tar gz per creare una cartella denominata X 3D NA dash V 2.1, che contiene il software 3D NA. Aprire l'applicazione terminale, solitamente disponibile nella cartella Utility su un Macintosh, e passare alla directory X 3D NA dash V 2.1.

Eseguire lo script di configurazione necessario affinché il 3D NA funzioni correttamente. Tutti i comandi utilizzati in questo video sono riportati nel protocollo testuale. Successivamente, copiare le due righe di impostazioni di esportazione visualizzate a schermo.

Se l'utente ha collocato il software nella directory delle applicazioni, le due righe dovrebbero apparire come mostrato qui. Aprire l'applicazione di modifica testi presente nella directory delle applicazioni. Nel menu Formato, selezionare Testo semplice.

Se esiste un file BRC, aprirlo come file di testo, modificare e incollare le impostazioni di esportazione alla fine del file. Se non esiste un file bash RC, incollare le impostazioni di esportazione in un file vuoto e salvarlo con il nome bash RC nella directory home. Per rendere disponibili le nuove impostazioni, eseguire il file Bash RC appena salvato all'interno del programma del terminale.

In questo video viene illustrata l'analisi di una struttura rappresentativa di acidi nucleici, il DNA legato alla proteina HBB del batterio Borrelia burgdorferi. Il primo passo nell'analisi 3D dell'acido nucleico è la creazione di un file che elenca tutte le basi appaiate. Questo viene effettuato digitando un comando per applicare il programma FindPairs alla struttura atomica contenuta nel file np_2mp_2.pdb.

Il passo successivo nell'analisi consiste nel determinare i parametri geometrici che caratterizzano la struttura. Il comando analyze utilizza come input il file delle coppie di basi e genera diversi file di output che appaiono nella directory di lavoro. I valori geometrici possono quindi essere calcolati digitando: analyze two MP two bps.

I file di output generati includono due MP due uscite, che contiene una panoramica dei parametri calcolati, e bpco step par, che contiene un elenco dei parametri del corpo rigido; oltre all'analisi di una struttura di acido nucleico, il software 3D NA offre la possibilità di costruire un modello strutturale a partire dai parametri del corpo rigido utilizzando il comando rebuild, al fine di creare un modello atomico approssimativo, che include coordinate sia per gli atomi dello scheletro che per quelli delle basi. Digitare il comando riportato nel testo. Questo comando indica a 3D NA di introdurre una conformazione standard del backbone BDNA nella costruzione di modelli a partire dai parametri del corpo rigido.

Un modello a doppia elica con i parametri del corpo rigido presenti nella struttura H-B-B-D-N-A può quindi essere costruito digitando il comando appropriato. Il file di parametri bpco step può essere modificato per generare una struttura alterata. In questo caso, vengono modificati gli angoli di rollio estremi formati nei due siti di massima curvatura.

La struttura viene quindi costruita utilizzando l'insieme modificato di parametri di passo come file di input. I due modelli possono essere visualizzati con un visualizzatore molecolare standard, a differenza dell'analisi di una singola struttura contenente acidi nucleici. Questa parte del video mostrerà come analizzare un grande insieme di strutture in un insieme di file, a partire dai nomi MD_ensemble_uno_PDB e terminando con un numero.

Il primo passo nell'analisi consiste nell'identificazione delle basi appaiate ottenute eseguendo il programma find pair come in precedenza, poiché l'intero insieme di strutture condivide lo stesso schema di appaiamento delle basi, è necessario eseguire find pair una sola volta su un file rappresentativo qui, il file che termina con 1001. Questo genera le informazioni sull'appaiamento delle basi e le memorizza nel file MD at set one BPS PS. Il passo successivo consiste nel trovare i parametri geometrici dell'intero insieme di strutture utilizzando il comando X3D ncore ensemble.Analyze. Successivamente, i parametri rigidi desiderati possono essere estratti dal file di output di riepilogo MD at set one out.

Questa operazione viene eseguita utilizzando l'estratto dell'ensemble Command X three DCO. Vengono estratti gli angoli di rollio e viene creato un file di testo con valori separati da virgola contenente gli angoli di rollio. Questo file può essere importato in altri programmi per ulteriori analisi e rappresentazioni grafiche.

La versione più recente di 3D NA dispone di una nuova funzionalità che consente all'utente di osservare più strutture da una prospettiva comune. Il comando reorienta l'insieme X tre DCO sovrapponendo un insieme di strutture correlate su una coppia di basi o su un passo tra coppie di basi comune, come nei protocolli precedenti. Il primo passaggio consiste nel calcolare l'appaiamento delle basi del DNA mediante il programma find pair.

In questo caso, il file di input è costituito da due file pdb KEK contenenti le 10 strutture della CIA coli, l'operatore O 3D NA legato alla parte terminale della proteina Repressore LAC. Il comando X three DCO ensemble reorient allineerà i modelli individuali all'interno di una struttura multimodello rispetto a un sistema di riferimento comune. Questo comando richiede come input sia il file PDB sia il file di appaiamento delle basi ottenuto nel passaggio precedente.

Inclusa nel comando è anche l'identità del passo della coppia di basi rispetto al quale vengono allineate tutte le strutture. L'interfaccia web W 3D NA comprende alcune delle funzionalità più utilizzate del pacchetto software 3D NA. Questa parte del video mette in evidenza la possibilità di costruire modelli tridimensionali di DNA associato a proteine mediante il server web.

Il primo passo per costruire un modello di DNA decorato con proteine è visitare il sito web W 3D NA all'indirizzo W three d.rutgers.edu. La selezione dell'opzione ricostruzione dal menu situato nell'angolo superiore sinistro della pagina attiva le funzionalità online per la costruzione del modello. Il passo successivo consiste nel selezionare il collegamento al modello di DNA con proteina legata, situato nella casella leggermente ombreggiata al centro della nuova pagina.

Questa selezione attiverà un menu a discesa, che consente all'utente di specificare il numero di proteine legate. La selezione del numero di proteine legate porta a una nuova pagina di specifica. L'utente potrà quindi digitare o incollare la sequenza desiderata.

Nella casella di testo, al centro della nuova pagina, è presente un menu a discesa sotto la casella di testo per selezionare la conformazione elicoidale delle regioni di DNA non legate. In prossimità della parte inferiore della pagina delle specifiche, è presente una casella di testo in cui inserire le posizioni di legame e i nomi dei file delle proteine legate. La posizione di legame indica la posizione del centro del frammento proteico legato sulla sequenza di DNA.

In fondo alla pagina di specifica, è presente una casella che consente all'utente di generare un'anteprima del DNA legato alla proteina. In questo caso, la casella viene selezionata e si fa clic sul pulsante continua. Questa azione genera una pagina di revisione che elenca i parametri selezionati, nonché eventuali errori che potrebbero essere derivati dall'overlap dei siti di legame selezionati.

L'utente può selezionare il pulsante indietro se sono necessarie modifiche oppure il pulsante crea per procedere. La pagina successiva mostra un'immagine statica del complesso DNA-proteina nella sua conformazione più estesa e consente una visualizzazione interattiva online tramite web. L'utente può inoltre scaricare un file contenente le coordinate atomiche.

Gli strumenti software 3D NA sono utilizzati regolarmente per analizzare le strutture degli acidi nucleici. I valori dei parametri del corpo rigido rivelano distorsioni nella struttura tridimensionale, come i due siti di flessione estrema del DNA nel solco maggiore con ampi angoli di rotazione positivi osservati ai passi 13 e 22. Nel complesso cristallino del DNA con la proteina Borrelia Bergdorf, RHBB.

La capacità del software di ricostruire strutture a partire da queste quantità permette di determinare in che modo i singoli passi delle basi e delle coppie di basi contribuiscono alla conformazione molecolare complessiva. Come illustrato in questo caso, la curvatura globale del DNA indotta dall'HBB riflette più delle due distorsioni estreme sopra menzionate. Il DNA mantiene un'elevata curvatura anche quando viene ricostruito con questi passi delle coppie di basi resi lineari.

Questo avviene quando i due valori più elevati del parametro sono stati impostati a zero. La nuova funzionalità della 3D NA di esaminare un elevato numero di strutture correlate rende possibile estrarre schemi sia dipendenti dalla sequenza che dal tempo nei raggruppamenti spaziali di molecole di DNA e RNA simulate. Ad esempio, il rivestimento di colore giallo degli angoli di rotazione tra coppie di basi successive in due ampi insiemi di strutture di DNA simulate rivela la flessione preferenziale di queste molecole nei passi di coppie di basi puriniche del Permiano.

I valori più elevati del parametro roll, mostrati in rosso, che persistono per brevi periodi alle estremità del DNA, suggeriscono un'apertura localizzata e un ripiegamento della struttura a doppia elica. I modelli variabili di altri parametri del corpo rigido, come gli angoli e le distanze tra basi complementari, possono contribuire a chiarire le precise distorsioni strutturali. La capacità del software 3D NA di riorientare molecole correlate in un sistema di riferimento comune rivela caratteristiche della struttura globale altrimenti nascoste in molti dei file conservati nella banca dati delle proteine.

Ad esempio, l'allineamento convenzionale di strutture correlate sulla base di un adattamento secondo la radice della media quadratica degli atomi corrispondenti produce una serie di percorsi spaziali simili che qui si sovrappongono approssimativamente l'uno all'altro: i 10 modelli basati su NMR dell'operatore O3D NA di Esia coli legato ai frammenti terminali della proteina del repressore LAC; la sovrapposizione di queste stesse strutture su un sistema di coordinate comune al paio di basi terminale al capo cinque di ciascun duplex rivela distorsioni notevoli della struttura globale, nelle quali le molecole si flettono in direzioni apprezzabilmente diverse. La variabilità strutturale può influenzare la facilità con cui la proteina del repressore LAC di CIA coli si lega a O tre e induce un'ansa tra O tre e operatori distanti in sequenza nell'operone LAC. Come illustrato qui, il posizionamento preciso di una proteina architettonica come HBB di Borrelia burgdorferi può avere un effetto drammatico sul ripiegamento complessivo del DNA.

Se due copie della nota struttura ad alta risoluzione sono separate da 43 paia di basi, un frammento di DNA di 81 paia di basi si chiude in una configurazione compatta, quasi circolare. Se le due proteine sono separate da cinque paia di basi aggiuntivi, il DNA segue un percorso aperto e tortuoso. Le configurazioni molto diverse del duplex decorato con proteine mostrano come la distanza tra proteine strutturali possa influenzare la ciclizzazione o la formazione di anelli nel DNA dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale degli acidi nucleici, permettendo di esplorare le interazioni tra DNA e proteine, il ripiegamento dell'RNA e la progettazione di nanoparticelle, al fine di ottenere una comprensione più approfondita dei difetti dello sviluppo e delle malattie come il cancro, nonché di progettare nuove terapie.