Ricostruzione di 3-Dimensional Volume Istologia e la sua applicazione per studiare mouse ghiandole mammarie

L'obiettivo generale del seguente video è quello di presentare un approccio di registrazione delle immagini per l'istologia tridimensionale, la ricostruzione del volume per studiare i cambiamenti nella macrostruttura cellulare mammaria. Per fare ciò, le ghiandole mammarie vengono asportate dai topi tre giorni dopo l'inizio dell'allattamento nei topi wild type e insulino-like che legano la proteina settima, IGF BP sette topi nulli. Le ghiandole vengono quindi lavorate e incorporate in blocchi di paraffina per il sezionamento.

Successivamente, vengono acquisite le immagini del viso del blocco ottico dei blocchi di tessuto e il blocco di tessuto viene sezionato. Le immagini delle sezioni vengono acquisite e, utilizzando un software personalizzato, ogni sezione viene allineata con l'immagine del quadrante del blocco corrispondente per ricostruire il volume istologico della ghiandola mammaria. I dati risultanti evidenziano differenze di dimensioni nelle ghiandole mutanti e wild type.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale tridimensionale, è che fornisce informazioni su un'estensione spaziale molto maggiore. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare e convalidare nuove tecniche e algoritmi nell'imaging e nelle terapie mediche volumetriche, nonché per creare analisi 3D ad alta risoluzione di diversi organi. Questo volume istologico ricostruito rappresenta una rappresentazione affidabile del campione di processo senza errori di registrazione propagati.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che i topi IGF P sette nulli hanno cucciolate più piccole e non sono in grado di sostenere più cucciolate di grandi dimensioni, quindi abbiamo deciso di studiare la struttura delle loro ghiandole mammarie. Una volta che il tessuto è stato incorporato nella paraffina, utilizzare un microtomo rotante per tagliare il blocco fino a rimuovere la paraffina in eccesso. Successivamente, utilizzando una fresatrice verticale, praticare fori di un millimetro in almeno due angoli del blocco di paraffina perpendicolare alla cassetta per montare il blocco di tessuto sul microtomo rotante.

Successivamente, per configurare il sistema di imaging del viso a blocchi davanti al microtomo, posizionare una fotocamera con un obiettivo tele leggermente inclinato rispetto alla superficie del blocco di tessuto. La fotocamera deve essere collegata a un computer davanti al microtomo. Quindi posiziona una fonte di luce davanti al blocco in modo tale che la fotocamera catturi il riflesso della luce dal blocco.

Regolare l'angolazione della telecamera fino a quando il tessuto sulla superficie del blocco è facilmente distinguibile dalla paraffina circostante. Cattura un'immagine del viso del blocco ottico. Quindi, utilizzando il microtomo, tagliare nastri di quattro sezioni, spessi cinque micron.

Trasferisci i nastri a bagnomaria, separa le sezioni del nastro, quindi raccogli la seconda e la quarta sezione dall'acqua fredda su uno scivolo. Trasferitele a bagnomaria per sciogliere le rughe. La scelta della seconda e della quarta sezione fornisce uno spazio di cinque micron tra le sezioni.

Una volta che non sono stropicciate, rimontate, le sezioni del microscopio scivolano scavando. Come in precedenza, si noti che il taglio, il montaggio e l'increspatura delle sezioni possono causare alcune distorsioni, come strappi, pieghe, restringimento ed espansione. Questi artefatti complicano la registrazione delle sezioni istologiche.

Colorare le sezioni con h e d utilizzando un coloratore automatico. Quindi slittare i vetrini utilizzando un montavetrini automatico utilizzando uno scanner istologico digitale per vetrini, digitalizzare i vetrini alla risoluzione di interesse. Per questo protocollo, l'ingrandimento è di 20 x e la risoluzione è di 0,47 micron.

Questa sezione del video offre una panoramica del processo di registrazione delle immagini, che viene realizzato utilizzando un software personalizzato sviluppato nel nostro laboratorio in combinazione con MATLAB c plus plus. Utilizzo di ITK Inizia con il downsampling delle immagini istologiche alla risoluzione delle immagini del volto del blocco. Ciò ridurrà le immagini istologiche di un fattore di 0,026.

Successivamente, per la segmentazione dell'immagine e la selezione dei punti, apri un paio di immagini di facce di blocchi in MATLAB e utilizza lo strumento cursore dati per misurare i valori dei pixel dei fori di registrazione. Utilizzare il valore medio dei pixel come soglia fissa per segmentare i fori di registrazione. Per rimuovere i segmenti in eccesso, utilizzare la circolarità e l'area degli oggetti segmentati per mantenere i fori e rimuovere i segmenti in eccesso.

Successivamente, per ogni ghiandola mammaria, selezionare un'immagine del viso a blocchi come riferimento. Allineare i centri dei fori di registrazione del resto del blocco, le immagini del viso ai centri dei fori di registrazione dell'immagine di riferimento. Quindi, utilizzando le trasformazioni ottenute per i fori di registrazione, allineare manualmente le immagini del viso del blocco per le immagini del quadrante del blocco allineate, segmentare o estrarre il tessuto dallo sfondo per le sezioni h e d.

Utilizzare la tecnica di soglia OSU per segmentare le immagini dallo sfondo e creare maschere binarie delle immagini istologiche. Successivamente, utilizzando l'istogramma degli oggetti etichettati, identificare e selezionare l'oggetto più grande in ciascuna maschera. Estrai i punti limite larghi un pixel sia dall'istologia che dalle maschere facciali a blocchi.

Successivamente, utilizzare un algoritmo di descrittori di Fourier per trovare la trasformata rigida iniziale tra i punti limite dell'istologia e le corrispondenti immagini della faccia del blocco. Questa trasformazione iniziale include i fattori di traslazione, rotazione e scala. Trasforma ogni immagine istologica con la trasformazione iniziale ottenuta dal passaggio precedente.

Per perfezionare la registrazione rigida, rimuovere le sezioni del bordo ad alta curvatura dal contorno istologico utilizzando un filtro a sfera rotante. Successivamente, utilizzando la distribuzione uniforme, selezionare casualmente 500 punti dai restanti punti di confine istologici. Trasformare i punti di confine istologici con la trasformazione iniziale ottenuta dai descrittori di Fourier.

Utilizza i punti di contorno della faccia del blocco e utilizza l'algoritmo iterativo dei punti più vicini per trovare la trasformazione rigida tra il blocco, i punti di contorno della faccia e l'istologia. Punti di confine casuali. Quindi trasforma le immagini istologiche ottenute dal passaggio precedente per creare un'immagine visiva del volume istologico nel software di visualizzazione 3D.

Me vis lab, scegli moduli, file vari e aggiungi il modulo 3D composto da file 2D. Quindi scegli l'immagine dal menu e aggiungi il modulo di conversione delle proprietà dell'immagine. Infine, aggiungi un modulo 3D di visualizzazione dai visualizzatori 3D di visualizzazione dei moduli.

Fare doppio clic su componi 3D da file 2D per caricare le immagini e fare clic su crea 3D. Regola la dimensione del voxel facendo doppio clic su converti proprietà immagine e imposta la dimensione del voxel come 0,018 0,018 0,01. Visualizza il volume facendo doppio clic su visualizza 3D.

Infine, visualizza la pila di immagini con un ingrandimento di cinque volte seguendo i passaggi nel documento allegato. Per caratterizzare meglio il deficit dell'I-G-F-B-P sette nulli di topo, è stata eseguita la ricostruzione 3D delle ghiandole mammarie come descritto nel presente documento. Queste figure mostrano i volumi istologici ricostruiti delle ghiandole mammarie wild type e null.

Si noti che la ghiandola mutante a destra è più corta e più stretta del tipo selvatico a sinistra, ma ha circa la stessa profondità con la ghiandola di tipo selvatico a 1,06 millimetri e la ghiandola nulla a 1,02 millimetri di profondità. Inoltre, si noti che le ghiandole wild type a sinistra hanno poco tessuto stromale indicato dalla colorazione eoin rosa, mentre le ghiandole nulle a destra sembrano essere prevalentemente tessuto stromale. Qui la colorazione dell'emato, che identifica le cellule nucleate, mostra che la ghiandola nulla mantiene la sua densità mentre la ghiandola di tipo selvatico sembra contenere principalmente strutture ghiandolari.

Per approfondire questo aspetto, qui sono state allineate immagini ad alta risoluzione dell'area del linfonodo. Si vedono grandi strutture, che sarebbero state riempite di latte. Al contrario, la ghiandola I-G-F-B-P a sette ghiandole nulle ha poche strutture ben sviluppate.

Inoltre, queste strutture sono affollate di fibroblasti come cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una ricostruzione 3D di un organo attraverso la ricostruzione delle sezioni seriali di scansione. Buono. Ora, mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare di nominare costantemente le diapositive e le scansioni poiché ci sarà un gran numero di entrambi e l'organizzazione sequenziale è la chiave del successo Seguire questa procedura.

Altri metodi, come l'immunoistochimica, per specifici marcatori cellulari e di malattia, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come la vascolarizzazione permea un tumore?