Quantificazione della densità di raggruppamento nelle ghiandole del mammella di ratto intere con il metodo di analisi di Sholl

L'obiettivo generale di questo metodo assistito da computer è quantificare in modo oggettivo la densità dei rami del dotto galattoforo e il decadimento della ramificazione, due indicatori dello sviluppo importanti nei roditori, applicando un'analisi di Sholl modificata a immagini di preparati interi del dotto galattoforo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo della biologia del dotto galattoforo, ad esempio in che modo l'esposizione a sostanze chimiche possa alterare lo sviluppo del dotto galattoforo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un software open source per quantificare in modo oggettivo caratteristiche fondamentali dello sviluppo del dotto galattoforo.

Per questa procedura, procurarsi immagini di preparati in toto che mostrino l'epitelio ghiandolare a un ingrandimento fisso. Per iniziare, aprire un'immagine in ImageJ. Successivamente, selezionare lo strumento a mano libera.

Delimitare l'epitelio ghiandolare e pulire l'area circostante. Successivamente, delimitare il linfonodo e rimuovere questa parte dell'immagine con il comando di taglio. Se lo sfondo dell'immagine è nero, deve essere convertito in bianco.

Fare clic su Modifica, quindi su Opzioni, quindi su Colori. Nella finestra di dialogo, selezionare il bianco dal menu a discesa delle opzioni di sfondo. Sebbene lo sfondo possa rimanere nero, verrà trattato come bianco durante l'elaborazione dell'immagine.

Ora, separare i canali colore in tre immagini in scala di grigi a otto bit. Quindi, selezionare il canale con il contrasto migliore, che di solito è il canale blu. Ora, sottrarre lo sfondo dal canale colore selezionato.

Quindi, procedere selezionando i parametri desiderati e visualizzando in anteprima le modifiche. Selezionare lo sfondo chiaro e visualizzare l'anteprima nella finestra di dialogo, quindi regolare il numero di pixel finché non si ottiene il contrasto desiderato. Se è necessario un contrasto aggiuntivo, utilizzare l'opzione Unsharp Mask.

Verificare l'anteprima nella finestra di dialogo e regolare il raggio in pixel e il peso della maschera fino a ottenere il contrasto desiderato. Dopo aver applicato il filtro di maschera di contrasto, rimuovere il bordo creato dal filtro. Fare clic sul pulsante con la doppia freccia rossa nella barra degli strumenti e selezionare Strumenti di disegno.

Quindi, selezionare lo strumento Gomma. Regolarne il diametro facendo clic con il tasto destro sul pulsante della gomma, quindi tenere premuto il pulsante sinistro del mouse per cancellare il bordo. Durante la cancellazione è consentito un solo livello di annullamento, quindi procedere con cautela.

Dopo aver applicato uno dei filtri, rimuovere manualmente il rumore residuo. Fare riferimento a una copia dell'immagine originale e rimuovere il rumore identificato cliccando prima sul pulsante con la doppia freccia rossa nella barra degli strumenti e selezionando gli strumenti di disegno. Quindi, scegliere lo strumento gomma.

Regola il suo diametro facendo clic con il tasto destro sul pulsante dello strumento gomma. Quindi, tieni premuto il pulsante sinistro del mouse per eliminare il rumore. Durante la cancellazione è consentito un solo livello di annullamento, quindi procedi con cautela.

Successivamente, regolare la soglia dell'immagine. Spostare i cursori per aggiustare i valori di soglia minima e massima al fine di migliorare l'immagine della ghiandola. Quindi, fare clic su Applica.

Rimuovere automaticamente il rumore aggiuntivo utilizzando uno dei due metodi. La prima opzione consiste nell'utilizzare il comando despeckle. La seconda opzione consiste nell'utilizzare il comando remove outliers.

Questo processo sostituisce un pixel con la mediana dei suoi immediati dintorni solo se il pixel si discosta dalla mediana di un valore superiore a una soglia definita dall'utente. Ora, utilizzando l'immagine originale come riferimento, ricostruire le porzioni dell'epitelio ghiandolare rimosse mediante sogliatura e rimozione del rumore. Durante la ricostruzione dell'immagine, accertarsi di eseguirla con attenzione e in misura minima per mantenere l'integrità dell'immagine.

Selezionare lo strumento aerografo dagli strumenti di disegno. Fare clic con il tasto destro sul pulsante dello strumento aerografo per regolarne le dimensioni, quindi riempire con attenzione le sezioni mancanti della ghiandola utilizzando il pulsante sinistro del mouse. Successivamente, creare un'immagine scheletrizzata della ghiandola per l'analisi di Sholl.

Prima, convertire l'immagine in un formato binario. Successivamente, eseguire la skeletonizzazione dell'immagine. Questo processo rimuove ripetutamente i pixel dai bordi dell'immagine binaria fino a ridurla a una forma larga un singolo pixel.

Ora, dilata l'immagine una volta per chiudere le lacune create dalla sogliatura e dallo skeletonizing. Successivamente, salva l'immagine come nuovo file utilizzando il comando salva con nome. Infine, verifica l'accuratezza dell'immagine dello scheletro rispetto all'originale sovrapponendo le due immagini.

Nella finestra di dialogo per l'aggiunta dell'immagine, selezionare l'immagine del tracciato scheletrico e impostarne l'opacità al 30%. Quindi, salvare la sovrapposizione come una nuova immagine per riferimenti futuri. Per iniziare, aprire un'immagine del tracciato scheletrico e convertire l'immagine in formato binario. A questo punto, definire la scala dell'immagine.

Inserire il numero di pixel per millimetro, quindi impostare sia la distanza nota che il rapporto d'aspetto dei pixel a uno; successivamente inserire i millimetri come unità di lunghezza e attivare l'opzione globale per applicare la scala a tutte le immagini. Successivamente, determinare il raggio finale per l'analisi di Sholl utilizzando lo strumento di disegno della linea. Tracciare una linea dall'inizio del dotto principale fino al punto più distale dell'epitelio ghiandolare.

Quindi premere il tasto M e verrà riportata la distanza della linea. Ora, inserire le impostazioni per l'analisi di Sholl. Prima di tutto, selezionare le opzioni nella sezione definizione dei gusci, impostare il raggio iniziale a 0,00 millimetri e il passo del raggio a 0,1 millimetri.

Impostare il numero di campioni su uno. La lunghezza della linea appena tracciata viene inserita automaticamente nel campo del raggio finale. Per le opzioni di più campioni per raggio, scegliere la media per l'integrazione.

Per i descrittori e le opzioni di adattamento curvilineo, impostare il valore limite del raggio di inclusione a uno. Scegliere dedotto dal raggio iniziale per il numero di rami primari e selezionare le opzioni di grado di adattamento lineare e migliore. Quindi, nella sezione profili senza normalizzazione, selezionare il più informativo.

Ora, nella sezione metodi di Sholl, selezionare area per il profilo normalizzato. Infine, nella sezione output, scegliere crea maschera di intersezione per generare una mappa termica delle intersezioni. Aprire ora una finestra di anteprima dell'immagine con gli anelli e confermare l'area di analisi.

Se tutto appare corretto, fare clic su OK per eseguire l'analisi. L'esecuzione dell'analisi creerà una finestra lineare del profilo sholl, una finestra semi-logaritmica del profilo sholl, una finestra dei risultati sholl, che contiene tutti i valori ottenuti dall'analisi sholl, e una finestra con il nome del file dei profili sholl, che fornisce il numero di intersezioni a ciascun raggio determinato dal polinomio. Per misurare il MEA, utilizzare l'immagine dello scheletro della ghiandola in ImageJ.

Aprire lo strumento poligono e disegnare un poligono attorno al perimetro della ghiandola. Utilizzare i clic del mouse per aggiungere segmenti di linea. Una volta delimitata l'intera area epiteliale, fare doppio clic per chiudere il poligono.

Quindi, premere il tasto M per aprire una finestra dei risultati. Il valore nella colonna area corrisponde all'MEA. Se l'epitelio ghiandolare si estende oltre il linfonodo, sottrarre l'area del linfonodo dall'MEA durante il calcolo della densità di ramificazione.

L'area del linfonodo può essere misurata nello stesso modo della MEA. Utilizzando i metodi descritti, sono stati analizzati due gruppi di ratti con età corrispondente. Gli animali del gruppo B sono stati trattati con una sostanza chimica nota per causare uno sviluppo precoce della ghiandola mammaria.

La rappresentazione del numero di intersezioni dei rami lungo il raggio della ghiandola illustra la variabilità dei risultati. I risultati dell'analisi di Sholl hanno rivelato una chiara differenza nel numero medio di intersezioni tra i gruppi. Tuttavia, i dati sulle intersezioni devono essere normalizzati rispetto all'area della ghiandola mammaria per trarre conclusioni.

L'analisi di Sholl e le misurazioni dell'area epiteliale della ghiandola mammaria forniscono due parametri fisiologici utili per effettuare analisi comparative. È evidente che la dimensione delle ghiandole era molto maggiore nel gruppo trattato. L'analisi di Sholl restituisce il valore di Sum N, che viene utilizzato per calcolare la densità di ramificazione e il valore di k.

Nel gruppo trattato, la maggiore densità media di ramificazione e il valore medio inferiore di k, che indica un tasso di decadimento della ramificazione più basso, suggeriscono che gli animali trattati avevano ghiandole più sviluppate rispetto agli animali non trattati. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare che l'eliminazione del rumore rappresenta il passaggio più cruciale. Rimuoverne troppo o troppo poco può compromettere l'integrità della ghiandola e alterare i risultati.

Quando si utilizza questo metodo, è importante iniziare con un intero monte mammario ben fissato. Un'immagine scheletrizzata accurata non può essere ottenuta se sono presenti imperfezioni, come strappi o pieghe. La creazione di un'immagine scheletrizzata accurata richiede pazienza e pratica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 15-20 minuti per ghiandola analizzata, se eseguita correttamente.