Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni
18 agosto 2014
Questa procedura mostra come indirizzare gli interneuroni nel prosencefalo del topo in via di sviluppo per mezzo dell'elettroporazione in utero. Questa tecnica è stata particolarmente efficace per ottenere l'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati agli strati superficiali della corteccia.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di colpire i neuroni interni nel cervello del topo in via di sviluppo mediante elettroporazione in utero. Ciò si ottiene preparando prima gli aghi per iniezione. Il secondo passo consiste nel rimuovere la catena embrionale dall'animale anestetizzato.
Quindi l'iniezione di DNA e l'elettroporazione vengono eseguite nel cervello. Il passo finale è quello di consentire all'animale di riprendersi dall'intervento chirurgico. In definitiva, in utero, l'elettroporazione viene utilizzata per consentire il targeting selettivo dei sottotipi interneuronali.
Il vantaggio di questi metodi delle nostre tecniche esistenti, è come l'elettrooperazione in utero aspecifica, è che fornisce i mezzi per effettuare l'analisi autonoma cellulare di un sottoinsieme di interneuroni corticali. Gli alti livelli di espressione di GFP consentono la visualizzazione e l'analisi di singoli inter. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del neurosviluppo, come ad esempio quali sono le regole che regolano l'integrazione dell'inter maturazione.
Per iniziare questa procedura, preparare la pipetta per microiniezione tirando un capillare di vetro con un estrattore per pipette. Successivamente, rimuovere con cautela il capillare e raccogliere l'ago inferiore per la microiniezione. Ora, posiziona un topo incinta anestetizzato con il lato ventrale rivolto verso l'alto sul termoforo.
Copri i suoi destini con una maschera che continuerà a fornire fluoro per tutta la durata dell'intervento. Quindi applicare il lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi. Imposta il termoforo a 36 gradi Celsius per prevenire l'ipotermia in seguito.
Verificare l'assenza di riflessi del piede e della coda pizzicando le zampe posteriori o la coda. Successivamente, pulire la pelle dell'addome con etanolo al 70%. Usa il forcipe per tirare la pelle verso l'alto.
Quindi praticare una piccola incisione verticale di due centimetri lungo la linea mediana iniziando a metà strada tra il terzo e il quarto paio di ghiandole mammarie. Fare attenzione a non danneggiare la parete addominale utilizzando una pinza rotonda. Estrarre delicatamente la catena embrionale dalla cavità.
Lasciare riposare la catena sulle salviettine umidificate. Inizia esponendo una metà dell'utero. Quindi continua con l'elettroporazione degli embrioni prima di passare all'altra metà.
In questa procedura, preparare la soluzione di DNA sciogliendo il pellet ottenuto da un protocollo standard di purificazione maxi prep in acqua distillata. Quindi aggiungere il verde veloce alla soluzione di DNA in un rapporto di uno a 20 per consentire la visualizzazione durante l'iniezione. Quindi, tagliare la punta di una micropipetta pre-estratta con una pinza fine per lasciare sei millimetri dall'inizio della spalla alla fine della punta.
Successivamente, caricare la micropipetta con un microlitro di soluzione di DNA con fast green per preparazioni iniettabili. Tenere la testa dell'embrione con una pinzetta rotonda. Inserire la pipetta nel cervello a 45 gradi, puntando al ventricolo laterale situato vicino alla linea mediana.
Se l'ago penetra attraverso il ventricolo, ritrarre lentamente la pipetta. Il ventricolo dovrebbe diventare verde quando la soluzione inizia a riempirlo. A questo punto, smettere di muovere la pipetta e iniettare un microlitro di DNA.
Quindi estrarre delicatamente la pipetta. Impostare l'ECM 8 30 su 5 impulsi da 45 volt di 50 millisecondi distanziati con un intervallo tra impulsi di 950 millisecondi. Immergere gli elettrodi a paletta da cinque millimetri in PBS per garantire una trasmissione efficiente della corrente.
Quindi posizionare le palette degli elettrodi attorno alla testa dell'embrione con una paletta positiva sul ventricolo contenente la soluzione di DNA. Posizionare la paletta positiva leggermente più in basso di quella negativa per creare una corrente ventrale attraverso le eminenze ganggliari. Ciò ridurrà al minimo l'espressione ectopica nelle cellule parametalliche.
Ora eroga un impulso premendo una volta il pedale, quindi rimuovi gli elettrodi e puliscili. Ripeti i passaggi per ciascuno degli embrioni. Dopo l'elettrostimolazione di tutti gli embrioni.
Versare tre millilitri di PBS nella cavità addominale e riportare gli embrioni nella cavità addominale. Quindi, sutura la parete addominale con un ago curvo e cinque suture di seta, quindi la pelle. Applicare lidocaina sulla ferita e somministrare 120 milligrammi per chilogrammo di aspirina inizialmente per l'analgesia.
Rimuovere l'animale dal tubo dell'anestesia e consentire il recupero sul termoforo su una salvietta di carta. Dopodiché, riporta l'animale nella gabbia. Tienilo sul termoforo a 37 gradi Celsius e monitora lo stato di salute.
In questo esperimento, gli interneuroni elettroporati sono delineati dall'espressione di marcatori di sottotipo derivati da CGE E. Questa immagine mostra che gli interneuroni derivati da CGE vengono elettroporati con un plasmide DLX cinque sei EGFP. Questa immagine mostra un interneurone VIP che esprime un interneurone a P otto.
L'espressione di EGFP delinea l'intero albero dendritico e l'arboro assonale dei singoli neuroni, e qui c'è un NPY che esprime interneurone a P otto. L'espressione di NP y delinea le cellule di forma della neuroglia. Infine, ecco un interneurone che esprime NPY a P 15.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se eseguita correttamente. Combinando l'uso di specifiche linee plasmidiche e di topi geneticamente modificati, è possibile ottenere un controllo temporale e speciale nell'espressione dei geni di interesse. In alcuni esperimenti, abbiamo utilizzato il plasmide A-D-L-X-T-T-A per indurre l'espressione di transgeni AU dipendenti.
In questi esperimenti, abbiamo taciuto l'espressione del transgene somministrando doxiciclina.
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Panoramica
Questa procedura illustra come indirizzare gli interneuroni nel proencefalo di topo in via di sviluppo mediante elettroporazione in utero. Questa tecnica consente un'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati ai livelli superficiali della corteccia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Espressione genica
Sfondo
- I neuroni intercalari svolgono un ruolo fondamentale nella funzione corticale.
- Indirizzare sottotipi specifici di neuroni intercalari può migliorare la comprensione delle loro funzioni.
- L'elettroporazione in utero è una tecnica potente per la manipolazione genica.
- Questo metodo consente un controllo preciso dell'espressione genica nei cervelli in via di sviluppo.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo per indirizzare gli interneuroni nella parte anteriore del cervello del topo.
- Raggiungere un'espressione genica selettiva in specifici sottotipi di interneuroni.
- Fornire un protocollo che possa essere replicato in altri studi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione degli aghi per iniezione.
- Rimozione della catena embrionale dall'animale anestetizzato.
- Iniezione di DNA nel cervello.
- Elettroporazione per facilitare l'espressione genica.
Risultati principali
- Indirizzamento mirato riuscito verso sottotipi di interneuroni nel proencefalo in via di sviluppo.
- Espressione genica efficiente ottenuta mediante il protocollo descritto.
- Potenzialità dimostrata per ulteriori studi sugli interneuroni corticali.
- Metodo affidabile fornito per ricerche future in neuroscienze dello sviluppo.
Conclusioni
- L'elettroporazione in utero è un metodo efficace per indirizzare gli interneuroni.
- Questa tecnica può essere utilizzata per studiare la funzione genica in popolazioni neuronali specifiche.
- Il protocollo può essere adattato per diverse progettazioni sperimentali nelle neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'indirizzamento selettivo per sottotipo degli interneuroni corticali consente una riduzione del rischio di natura meccanicistica nella validazione di bersagli neurosviluppali. Questo approccio sostiene la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, collegando la manipolazione genetica a popolazioni neuronali definite. Affronta un punto critico nella selezione del portafoglio, in cui la specificità biologica riduce il rischio di abbandono nelle fasi avanzate.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in sottotipi definiti di interneuroni GABAergici.
- Valore operativo: Offre una riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale specifica per sottotipo.
- Valore strategico: Favorisce la fiducia predittiva e il triage del portafoglio isolando i meccanismi causali in sistemi rilevanti per la malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi con risoluzione per sottotipo.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi mediante espressione del reporter indotta da elettroporazione.
- Valore strategico: Consente una valutazione affidabile dei composti in contesti neuronali rilevanti per la malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la malattia attraverso l'allineamento dei sottotipi di interneuroni corticali con la patofisiologia umana.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mediante una strategia di targeting coerente.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio collegando l'interazione con il bersaglio a esiti fenotipici in circuiti definiti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica, consentendo un affinamento iterativo dei modelli meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei sottotipi di interneuroni corticali.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e output quantitativi mediante l'espressione di un reporter fluorescente in cellule elettroporate.
- Analisi: Offre letture misurabili (ad esempio, intensità di GFP, localizzazione subcellulare) per confrontare condizioni genetiche o farmacologiche.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso marcatori di interneuroni conservati tra specie diverse.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per il controllo genico temporale e spaziale su più bersagli e modelli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei percorsi neurosviluppati.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della somministrazione genica specifica per sottotipo.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi per il sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate sull'interazione con l'obiettivo specifico per sottotipo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia embrionale, microchirurgia e tecniche di elettroporazione in utero.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi estrattori di pipette, elettroporatori e sistemi di imaging fluorescente.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra gruppi che si occupano di chirurgia animale, biologia molecolare e imaging.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diverse linee di topi, tempistiche gestazionali e costrutti plasmidici.
- I limiti pratici includono la vitalità degli embrioni dopo l'intervento chirurgico e la variabilità dell'efficienza di elettroporazione tra diverse nidiate.
