Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare Staphylococcus epidermidis E Mycobacterium marinum Infezione come modello per Drug Discovery
26 giugno 2014
In questo articolo video descrive l'alta velocità oleodotto che è stato stabilito con successo per infettare e analizzare un gran numero di embrioni di zebrafish fornire un nuovo potente strumento per il test composto e la scoperta di farmaci utilizzando un intero organismo vertebrato.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare un gran numero di embrioni di pesce zebra infetti per test di composti ad alto rendimento per consentire la scoperta di farmaci. Ciò si ottiene utilizzando prima una grande nave da riproduzione per ottenere un gran numero di uova sincrone di zebrafish in un singolo evento. Successivamente, le uova vengono allineate in una griglia aros e infettate con batteri nel tuorlo utilizzando un micro iniettore automatizzato.
Quando l'infezione si è diffusa attraverso gli embrioni, questi vengono preselezionati mediante citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni prima di essere trattati con farmaci. Infine, i livelli di carica batterica negli embrioni infetti vengono analizzati dopo il trattamento composto. In definitiva, analisi ad alta risoluzione attraverso microscopia confocale vertebrale.
Lo screening automatizzato e il campionamento di particelle di grandi dimensioni vengono utilizzati per mostrare con maggiore dettaglio gli effetti che i composti hanno sull'infezione. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti come le iniezioni manuali o l'analisi PIX, è che con esso possiamo generare una grande quantità di embrioni affetti in modo omogeneo, che possiamo analizzare in modo ad alto rendimento. Per preparare l'inoculo di S epiderm, isolare diverse colonie individuali da una piastra di ceppo di S epiderm, O 47 contenente un vettore di espressione di ciliegia M derivato da PW VW 180 9 e inoculare.
25 millilitri di LB integrati con 10 microgrammi per millilitro. Incubare il cloramfenicolo per una notte a 37 gradi Celsius fino allo stadio intermedio il giorno successivo, centrifugare un millilitro di coltura a 12.000 GS per un minuto e utilizzare un millilitro di PBS sterile con lo 0,3% di volume per volume tra 80 per lavare il pellet tre volte. Misurare la densità ottica a OD 600 e utilizzare il 2% in peso per volume, il polivinilperone 40 o il PVP 40 in PBS per diluire la sospensione batterica a un OD 600 pari a 0,3 o una volta 10 alle otto CFU per millilitro.
Per preparare l'inoculo di aminum, isolare diverse colonie individuali dal ceppo M Meum M o E 11 che esprimono stabilmente il vettore di ciliegia PS MT 3M da un aerato Middlebrook seven H 10 e inoculare 10 millilitri di brodo Middlebrook seven H nine contenente il 10% di volume per volume. L'arricchimento DC Middlebrook A integrato con 50 microgrammi per millilitro di igromicina incuba per una notte a 28 gradi Celsius il giorno successivo. Centrifugare un millilitro di coltura a 12.000 GS per un minuto e utilizzare un millilitro di PBS sterile con lo 0,3% di volume per volume tra 80 per lavare il pellet tre volte.
Misurare il diametro esterno 600 della sospensione batterica e con il 2% in peso per volume. PVP 40 in PBS diluito a un OD 600 di 0,3 o 0,3 volte 10 alle otto CFU per millilitro per ottenere uova di pesce zebra la notte prima della raccolta, posizionare un massimo di 50 femmine di pesce zebra nella camera inferiore di un grande recipiente da riproduzione e 70 maschi nella parte superiore del vaso. La mattina successiva, rimuovere il separatore dal recipiente Dopo circa un'ora attraverso il raccoglitore di uova sul fondo del recipiente di riproduzione, raccogliere le uova in un tubo da 50 millilitri riempito con acqua d'uovo.
Dopo aver preparato le piastre di iniezione, secondo il protocollo di testo sul software operativo automatizzato del micro iniettore, fare clic sulla fase di calibrazione, quindi fare clic su 10 24. Griglia del pozzetto e posiziona la piastra aros nel micro iniettore, calibra la piastra cliccando sullo schermo nella posizione centrale del pozzetto. Quindi vai al menu dell'ago e fai clic su calibra portaago.
Utilizzando una punta per micro caricatore, riempire un ago per iniezione con punta di 10 micron di diametro con 10 microlitri di PVP 40 contenente 100 CFU per nanolitro di S epiderma, 30 CFU per nanolitro di siero o PVP 40 da solo per le iniezioni simulate, posizionare l'ago nel micro iniettore automatizzato e calibrare la posizione XY abbassando o spostando l'ago verso l'alto e facendo clic sullo schermo nella posizione dell'ago. Quindi calibrare la posizione Z dell'ago facendo clic sullo schermo nella posizione della punta dell'ago. Quindi, utilizzare una pipetta di plastica per distribuire le uova sulla griglia aros e rimuovere l'acqua in eccesso.
Quindi posizionare la griglia agros piena di uova nel micro iniettore automatizzato nel menu di iniezione, regolare l'impostazione della pressione di iniezione su 200 ettari pascal, il tempo di iniezione a 0,2 secondi e la pressione di compensazione a 15 Hector Pascals, che è correlata a un nanolitro nel menu delle impostazioni del getto Femto. Fare clic su iniettare tutto e iniettare l'intera piastra di embrioni dopo l'iniezione. Raccogli le uova lavandole in una capsula di Petri e incubale a 28 gradi Celsius.
Una volta configurato il citometro a flusso di particelle di grandi dimensioni, accedere al menu PMT e impostare il canale rosso a 650 volt e i canali verde e giallo a zero volt. Quindi, all'interno del menu delle soglie, impostare il segnale di soglia della densità ottica su 50, corrispondente a 975 millivolt e il tempo di volo minimo a 800, corrispondente a 320 microsecondi. Per ridurre l'influenza dei detriti, posizionare gli embrioni nella tazza del campione e nel menu di ordinamento per trovare il massimo di 70 embrioni per piastra da smistare inserendo 70.
Posiziona una capsula di Petri vuota sotto lo smistatore e fai clic su ordina manualmente. Quando la capsula di Petri è piena, salvare i dati facendo clic su memorizza. Se è necessaria un'analisi o un imaging ad alta risoluzione, gli embrioni possono essere ordinati singolarmente in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
Posizionare gli embrioni nella tazza del campione e definire il massimo di un embrione per pozzetto da selezionare. Quindi posizionare una piastra vuota da 96 pozzetti nel portapiastra sinistro e fare clic sulla piastra di riempimento. Quando la piastra è piena, salva i dati facendo clic su Memorizza per analizzare gli embrioni trattati con il farmaco tre giorni dopo l'iniezione con erum.
Trattare un gruppo di embrioni con un composto di interesse in solvente e un secondo gruppo con solo solvente. Posizionare gli embrioni trattati a quattro e cinque giorni dopo la fecondazione nella coppa del campione sul citometro a flusso e impostare la selezione a 70 embrioni per piastra dopo aver anestetizzato gli embrioni in trica e aver impostato il sistema di screening automatizzato dei vertebrati e il campionatore di particelle di grandi dimensioni. In base al protocollo di testo dal menu di configurazione del rilevamento degli oggetti di imaging, selezionare le immagini di riferimento corrispondenti all'età degli embrioni nel menu di memorizzazione automatica delle immagini di imaging, selezionare il numero di immagini da creare e l'orientamento da utilizzare.
Posizionare una piastra a 96 pozzetti riempita di embrioni nel supporto sinistro del campionatore di particelle grande e fare clic sulla piastra di esecuzione. Quando un embrione è posizionato correttamente, utilizzare un obiettivo a secco 10 x e visualizzare separatamente la testa e la coda. Quindi utilizzare un software di elaborazione delle immagini per unire le immagini per valutare quale stadio di sviluppo è il migliore per l'infezione da tuorlo.
Sono state eseguite iniezioni con dermite e marum in tutti i diversi stadi tra quello di una e quella di 512 cellule. Come si vede qui, le iniezioni con 100 CFU di dermite eseguite tra lo stadio di 16 e 128 cellule hanno fornito il miglior modello di infezione. I batteri proliferavano all'interno del tuorlo per tre giorni e si diffondevano nel corpo da tre giorni dopo l'infezione in poi.
La quantificazione ad alto rendimento della carica batterica è stata eseguita mediante analisi dell'intensità della fluorescenza utilizzando il citometro a flusso di particelle di grandi dimensioni. Come mostrato qui, la quantità di batteri vivi presenti all'interno dell'embrione corrisponde molto bene al segnale fluorescente misurato. Questa cifra dimostra che lo stadio di sviluppo ottimale per l'iniezione di 30 CFU di aminum è compreso tra lo stadio di 16 e 128 cellule per il ceppo E 11 e tra lo stadio di 16 e 64 cellule.
Con il ceppo EM più virulento, gli embrioni iniettati in queste fasi hanno mostrato una crescita batterica all'interno della quercia e la diffusione dei batteri attraverso l'embrione. Dopo il trattamento pre-pregresso di embrioni infetti da emerina con diverse concentrazioni di rifampicina ha mostrato una riduzione dell'infezione micobatterica in modo dose-dipendente. L'uso del farmaco alla dose di 200 micromolari ha dimostrato di aver efficacemente fermato la progressione batterica di M mein E 11, 24 ore e oltre dopo il trattamento Dopo il suo sviluppo.
Queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo della sperimentazione dei composti e dello sviluppo di farmaci, alla ricerca di nuovi trattamenti per malattie infettive come la tubercolosi o le infezioni associate ai biomateriali.
Panoramica
Questo articolo video descrive una procedura ad alto rendimento sviluppata per infettare e analizzare un elevato numero di embrioni di pesce zebra, fornendo uno strumento potente per la sperimentazione di composti e la scoperta di farmaci.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Scoperta di farmaci
- Biologia delle infezioni
Sfondo
- Gli embrioni di zebrafish sono utilizzati come organismo modello per lo studio delle infezioni.
- Metodi ad alto rendimento consentono l'analisi di grandi dimensioni campionarie.
- Tecniche automatizzate migliorano l'efficienza e la riproducibilità negli esperimenti.
- La sperimentazione farmacologica su embrioni infetti può rivelare l'efficacia dei composti.
Scopo dello studio
- Generare un elevato numero di embrioni di pesce zebra infetti da sottoporre a test.
- Analizzare gli effetti di composti su infezioni batteriche.
- Potenziare i processi di scoperta di farmaci utilizzando un modello vertebrale.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un contenitore di allevamento di grandi dimensioni per il prelievo sincrono di uova.
- Microiniezione automatizzata di batteri nel tuorlo del pesce zebra.
- Citometria a flusso per particelle di grandi dimensioni per il sorting degli embrioni.
- Microscopia confocale per l'analisi ad alta risoluzione delle infezioni.
Risultati principali
- L'infezione riuscita degli embrioni consente un'analisi ad alto rendimento.
- I metodi automatizzati producono embrioni uniformemente colpiti.
- Gli effetti del trattamento farmacologico possono essere valutati quantitativamente.
- L'immagine ad alta risoluzione rivela interazioni dettagliate tra composti e infezioni.
Conclusioni
- La procedura consolidata migliora in modo significativo gli sforzi nella scoperta di farmaci.
- Le tecniche automatizzate forniscono risultati affidabili e riproducibili.
- Questo metodo può essere adattato a diversi scenari di test dei composti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello di infezione ad alto rendimento nel pesce zebra colma il divario tra saggi basati su cellule e la validazione in vivo nei mammiferi, consentendo lo screening di composti nelle fasi iniziali con rilevanza fisiologica nell'intero organismo. Generando un elevato numero di embrioni infettati in modo sincrono, il metodo fornisce una maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi e riduce l'insuccesso nelle fasi avanzate dei percorsi di scoperta di farmaci anti-infettivi. Il flusso di lavoro scalabile accoglie diversi patogeni batterici e librerie di composti, migliorando la continuità traslazionale dall'identificazione dei composti attivi alla valutazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in un contesto di infezione su animale intero, chiarificando le interazioni tra patogeno e ospite e l'essenzialità dei bersagli.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante modelli di infezione omogenei e sincronizzati, che riducono la variabilità nei risultati dello screening fenotipico.
- Valore predittivo: Facilita decisioni precoci di tipo go/no-go quantificando gli effetti del composto sul carico batterico in vivo, migliorando l'efficienza nel triage del portafoglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per la preparazione di sistemi biologici validati, adatti alla successiva valutazione di composti.
- Valore operativo: Utilizza microiniezione automatizzata e citometria a flusso per particelle di grandi dimensioni per garantire coerenza del saggio, scalabilità e elevata capacità di elaborazione dei campioni.
- Prontezza per lo screening: Genera letture quantitative basate sulla fluorescenza del carico batterico, consentendo analisi dose-risposta affidabili e conferma dei risultati positivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Mantiene la rilevanza per le malattie modellando infezioni da Staphylococcus epidermidis e Mycobacterium marinum, che rispecchiano patologie associate a biomateriali e correlate alla tubercolosi.
- Allineamento preclinico: Supporta decisioni di avanzamento con valutazione del rischio collegando segnali precoci di efficacia a meccanismi antimicrobici noti, come l'inibizione dipendente dalla dose di rifampicina.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Consente l'uso di linee di zebrafish transgenici per decifrare il meccanismo d'azione del composto, rafforzando la fiducia sul bersaglio prima degli studi nei mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto attivo fino alla sperimentazione preclinica dell'efficacia, in particolare per programmi anti-infettivi che richiedono una validazione su animali interi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'infezione e dell'interferenza dei composti in un ospite vertebrato.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso l'allineamento automatizzato degli embrioni, l'iniezione precisa nel tuorlo e il presorting mediante citometria a flusso, per assicurare condizioni iniziali uniformi.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative delle variabili dipendenti tramite l'analisi dell'intensità di fluorescenza, consentendo un confronto oggettivo del carico batterico tra i diversi gruppi di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica attraverso il profilo dose-risposta di antibiotici noti, stabilendo biomarcatori predittivi dell'efficacia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per lo screening di diverse librerie di composti contro multipli patogeni, riducendo la dipendenza dallo sviluppo di saggi su misura.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione del target riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso l'osservazione diretta della modulazione dell'infezione in vivo.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità grazie a flussi di lavoro automatizzati e alla produzione sincronizzata di embrioni.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione, l'efficienza del capitale e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei programmi anti-infettivi.
- Impatto sul portafoglio: Consente decisioni di priorità e avanzamento corrette per il rischio basate su dati quantitativi di efficacia in vivo derivanti da schermate ad alta produttività.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allevamento di zebrafish, nelle tecniche di microiniezione e nell'uso della citometria a flusso.
- Dipende da microiniettori automatici, citometri a flusso per particelle grandi e sistemi di rilevamento della fluorescenza.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di infezione, la preparazione dei composti e le procedure di analisi dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse ceppi batterici, linee transgeniche e letture dell'infezione in base alla virulenza del patogeno e alla risposta dell'ospite.
- I limiti pratici includono i vincoli sulla vitalità degli embrioni dopo l'infezione e la necessità di ottimizzare i titoli dell'inoculo batterico per garantire una penetrazione costante del fenotipo.
