Corsa di modellazione in Mouse: Coagulazione permanente dell'arteria cerebrale media distale
31 luglio 2014
Vari modelli murini di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) sono ampiamente utilizzati nella ricerca sul cervello sperimentale. Qui, dimostriamo il modello di transcranica permanente distale MCAO che produce coerente infarto corticale di misura corrispondente al danno imposto dalla maggioranza degli ictus ischemici umani.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di effettuare un'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media distale di un topo con un infarto risultante che si trova principalmente nella corteccia e relativamente grande quanto gli ictus umani. Ciò si ottiene assegnando un primo punteggio al basale per l'asimmetria dell'uso degli arti prima dell'intervento chirurgico. Il passo successivo della procedura consiste nell'eseguire l'intervento chirurgico di induzione dell'ictus mediante elettrocoagulazione dell'arteria cerebrale media distale.
Dopo l'intervento chirurgico, i deficit motori sensoriali focali vengono testati valutando quattro asimmetrie nell'uso degli arti. Di nuovo. Il passaggio finale consiste nell'analizzare il volume dell'infarto utilizzando la colorazione crestale viola. In definitiva, le lesioni corticali risultanti sono di dimensioni moderate con piccole variazioni, il che rende questa tecnica un modello prezioso per la ricerca di base e traslazionale sull'ictus.
I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri modelli di ictus comuni sono che il tasso di mortalità in questo modello è minimo, il volume dell'infarto e la localizzazione. La neocorteccia rappresenta la maggior parte degli ictus umani ed è altamente riproducibile. In generale, per quanto riguarda questo metodo, ci troveremo prima di tutto con la rimozione delicata del cranio per ridurre al minimo le lesioni meccaniche.
In secondo luogo, la corretta identificazione e la corretta correlazione dell'arteria sal media distale sono fondamentali per questo modello. Innanzitutto, iniettare analgesici 30 minuti prima di iniziare l'operazione. Accendi la coperta termica per il mouse e impostala a 37 gradi Celsius per l'operazione.
Quindi, assicurati che il gas anestetico composto per il 70% da azoto, per il 30% da ossigeno e isofluoro sia pronto. Quindi esporre il mouse al 4% di fluoro ISO in una camera di induzione fino a quando non smette di muoversi. Quindi posizionare il mouse sul termoforo e somministrare fluoro al 4% per un altro minuto.
Dopo il minuto, modificare il tasso di fluoro isof all'1,5% Ora, assicurati che il topo sia sufficientemente anestetizzato con un pizzico di dita dei piedi e, in tal caso, applica l'etanolo dafan sugli occhi usando le forbici. Inizia l'intervento con un'incisione di un centimetro tra l'orecchio e l'occhio. Separare la pelle e identificare il muscolo temporale.
Ora sul generatore ad alta frequenza, impostare la funzione sulla coagulazione, la modalità bipolare, la potenza a 12 watt e collegare la pinza. Durante la preparazione, aggiungere una goccia di soluzione salina al muscolo temporale esposto. Quindi utilizzare la pinza per elettrocoagulazione per staccare il muscolo temporale dal cranio nelle sue parti apicali e distali.
Il risultato è un lembo muscolare allentato. Ora identifica l'arteria cerebrale mediale o MCA sotto il cranio trasparente. Si trova nella parte rostrale dell'area temporale, dorsale al seno retroorbitale.
Usa un trapano per assottigliare l'osso direttamente sopra questa arteria fino a quando non è fluente. Mantenere il cranio umido durante la perforazione con soluzione salina. Ora usando una pinza molto sottile, rimuovi con cura l'osso per esporre il ramo MCA.
Cambia il generatore ad alta frequenza a sette watt. Ora coagula l'arteria con la pinza per elettrocoagulazione toccandola delicatamente senza afferrarla. Coagulare l'arteria sia prossimalmente che distalmente alla biforcazione nel caso di una variazione anatomica senza la biforcazione della MCA, coagulare l'arteria il più prossimalmente possibile in due siti, a circa un millimetro di distanza dopo la coagulazione.
Attendere 30 secondi e poi toccare delicatamente l'arteria con una pinza smussata. Quindi, riposizionare il muscolo nella sua posizione coprendo il foro della fresa. Sutura la ferita e metti l'animale in una scatola per l'allattamento a 32 gradi Celsius per riprendersi dall'anestesia e rimetterlo nella gabbia.
In generale, l'animale impiega dai cinque ai 10 minuti per riprendersi dall'anestesia. Il test del cilindro verifica la preferenza di uno per l'arto rispetto all'altro. Posiziona l'animale in un cilindro di vetro acrilico trasparente fiancheggiato da due specchi ad angolo retto.
Filma l'animale per cinque minuti di fronte al vertice dei due specchi dall'altra parte del cilindro. Dopo ogni prova, pulire il cilindro e il piano del tavolo con etanolo al 60%. Successivamente, eseguire un'analisi fotogramma per fotogramma.
Segna il test contando il contatto di una zampa da quattro al cilindro mentre è completamente sollevato e anche contando l'atterraggio con un arto da quattro. Dopo un punteggio posteriore completo, almeno 20 contatti di un quarto arto per sezione criogenica di prova, ogni cervello in serie in sezioni spesse 20 micrometri prelevate a intervalli di 400 micrometri. Raccogli le sezioni sui vetrini per conservarle a meno 20 gradi Celsius.
Utilizzando questo protocollo di sezionamento, tutte le sezioni che coprono l'area dell'infarto da un cervello possono essere posizionate su un vetrino. Colorare le sezioni utilizzando un protocollo standard di viola crestale per delineare l'area del tessuto infartuato di ciascuna sezione cerebrale. I vetrini possono quindi essere montati, scansionati e analizzati utilizzando il metodo Swanson per l'edema.
La mortalità per correzione dovuta all'intervento di occlusione MCA è stata inferiore al 5% a causa principalmente di subaracnoide, emorragie o anestesia errata. Nessuno è morto durante il periodo. Per questa analisi per l'uso di PA, l'asimmetria è stata misurata utilizzando il test del cilindro dopo l'induzione dell'ictus e, rispetto ai valori basali ottenuti prima dell'occlusione MCA, è stata rilevata un'asimmetria significativa degli arti a 24 ore, che si è parzialmente ripresa durante la prima settimana dopo l'ictus, una settimana dopo l'ictus.
L'infarto di induzione voltri con colorazione crestale viola ha misurato il volume medio dell'infarto a 15,4 millimetri cubi, rappresentando così circa il 12% di un emisfero cerebrale. La deviazione standard di questo modello è molto bassa. Inoltre, la localizzazione dell'infarto aveva una variabilità minima.
Una volta terminata, questa operazione può essere completata entro 10 minuti se eseguita correttamente. Oltre ai test dimostrati sui cilindri e alla colorazione con cristallovioletto, è possibile utilizzare altri test comportamentali e metodi istologici consolidati per caratterizzare ulteriormente il risultato e affrontare specifiche domande di ricerca. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'occlusione MCA distale permanente nei topi.
Si consiglia vivamente di utilizzare procedure operative standard e una documentazione dettagliata per mantenere la riproducibilità del metodo.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per eseguire un'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media distale (MCAO) nei topi, che determina un'infarto corticale costante simile agli ictus ischemici umani. La tecnica è utile sia per la ricerca di base che per quella traslazionale sull'ictus, grazie alla sua riproducibilità e al tasso minimo di mortalità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sull'ictus
- Modelli animali
Sfondo
- Occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è un modello comune per lo studio dell'ictus ischemico.
- Questo modello permette l'esame dell'infarto corticale in un ambiente controllato.
- La comprensione dei meccanismi dell'ictus nei topi può fornire informazioni applicabili alle condizioni umane.
- Riproducibilità e bassi tassi di mortalità aumentano l'utilità del modello nella ricerca.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per indurre un'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (MCAO) nei topi.
- Valutare l'entità dell'infarto corticale risultante e la sua rilevanza rispetto agli ictus umani.
- Valutare gli esiti comportamentali dopo l'intervento chirurgico mediante test di asimmetria nell'uso degli arti.
Metodi Utilizzati
- Valutazione iniziale dell'asimmetria nell'uso degli arti prima dell'intervento chirurgico.
- Elettrocoagulazione dell'arteria cerebrale media distale per indurre un ictus.
- Valutazione post-operatoria dei deficit sensori-motori mediante il test del cilindro.
- Analisi del volume dell'infarto attraverso la colorazione con violetto cresteo di sezioni cerebrali.
Risultati principali
- Il volume medio dell'infarto misurava 15,4 millimetri cubi, pari a circa il 12% di un emisfero cerebrale.
- È stata rilevata un'importante asimmetria degli arti a 24 ore dall'intervento chirurgico, con un recupero parziale osservato nella settimana successiva.
- Il modello ha mostrato una bassa variabilità nella localizzazione e nelle dimensioni dell'infarto.
- La mortalità dovuta alla procedura è stata inferiore al 5%, principalmente causata da emorragia subaracnoidea o errori nell'anestesia.
Conclusioni
- Il metodo MCAO descritto è efficace per lo studio dell'ictus ischemico nei topi.
- Fornisce un modello riproducibile con minima mortalità e risultati costanti.
- Test comportamentali e analisi istologiche possono ulteriormente caratterizzare gli effetti dell'ictus.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello consente un'infarto corticale riproducibile nei topi con bassa mortalità, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi per l'ictus. Le dimensioni e la localizzazione dell'infarto sono allineate alla patologia dell'ictus umano, aumentando la rilevanza traslazionale per la valutazione terapeutica preclinica. Gli esiti comportamentali e istologici forniscono endpoint quantitativi per decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi iniziali di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche nei percorsi del colpo ischemico corticale con elevata rilevanza anatomica per la patologia umana.
- Valore operativo: La bassa variabilità del volume e della localizzazione dell'infarto aumenta la fiducia nelle valutazioni dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso.
- Valore predittivo: Supporta il triage preclinico modellando meccanismi fisiopatologici ritardati come l'infiammazione, l'angiogenesi e la plasticità neuronale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce lesioni corticali standardizzate adatte a schermate coerenti di composti e valutazioni di risposta alla dose.
- Risultati quantitativi: La misurazione del volume dell'infarto mediante colorazione con violetto cresile consente un'analisi obiettiva di tipo istomorfometrico degli effetti del trattamento.
- Scalabilità: La procedura chirurgica si completa in meno di 10 minuti con una mortalità minima, favorendo un'elevata produttività nei flussi di lavoro di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: La predominanza dell'infarto corticale rispecchia la maggior parte degli ictus ischemici umani, migliorando l'affidabilità predittiva per la traduzione clinica.
- Continuità meccanicistica: Permette lo studio delle vie dell'ictus subacuto e cronico, inclusi rigenerazione e plasticità, in finestre di osservazione prolungate.
- Progresso aggiustato per il rischio: La bassa mortalità e l'elevata riproducibilità riducono la variabilità biologica, consentendo valutazioni precliniche di efficacia e sicurezza più affidabili.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta dell'ictus, dalla validazione del bersaglio fino all'identificazione del capostazione e ai test di efficacia preclinica, in particolare per le terapie mirate ai meccanismi di danno e riparazione corticale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su composti neuroprotettivi e neuro-riparatori in un modello di infarto clinicamente rilevante.
- Screening: Permette la generazione standardizzata di infarti per una valutazione costante degli effetti dei composti sulla progressione della lesione.
- Analisi: La colorazione con violetto cresile e il test del cilindro forniscono letture complementari, istologiche e funzionali, per analisi dose-risposta e di andamento temporale.
- Ricerca traslazionale: Modella processi fisiopatologici ritardati rilevanti per le finestre temporali di intervento nello stroke subacuto e cronico.
- Riutilizzo aziendale: Procedure chirurgiche e analitiche standardizzate consentono la riproducibilità tra progetti e la condivisione della piattaforma tra gruppi di ricerca in neuroscienze.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Un'elevata fedeltà anatomo-patofisiologica rispetto all'ictus umano aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi terapeutici.
- Valore operativo: Una mortalità minima e una bassa variabilità dell'infarto migliorano la riproducibilità del saggio e riducono il numero di animali necessari per ogni esperimento.
- Valore strategico: Consente l'identificazione precoce di composti biologicamente attivi, riducendo il rischio di fallimento nelle fasi avanzate dei programmi per l'ictus.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione basata sui dati degli obiettivi terapeutici, in base alla modulazione costante della dimensione dell'infarto e del recupero funzionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche microchirurgiche e nell'identificazione dei vasi intracranici.
- Dipende da apparecchiature per elettrocoagulazione e da impostazioni precise della potenza per l'occlusione arteriosa.
- Necessita di protocolli standardizzati di anestesia e di cure postoperatorie per ridurre al minimo la variabilità.
- L'adattamento a modelli transgenici richiede la validazione della fattibilità chirurgica e della coerenza dell'infarto.
- L'analisi istologica richiede protocolli standardizzati di sezionamento e colorazione per una quantificazione affidabile dell'infarto.
