Imaging Ca ²⁺ Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare i segnali di calcio evocati dallo stimolo luminoso dai fotorecettori dei coni nella retina del topo utilizzando un biosensore fluorescente. Ciò si ottiene isolando la retina da una linea di topi transgenici che esprime un sensore di calcio geneticamente codificato esclusivamente nei fotorecettori dei coni. Il secondo passo consiste nel tagliare fette verticali del tessuto retinico.

Successivamente, le fette di retina vengono montate sui vetrini coprioggetto e poste sotto un microscopio a due fotoni. Il passaggio finale consiste nel registrare i segnali di calcio dai singoli terminali sinaptici dei fotorecettori dei coni in risposta alla stimolazione luminosa. Infine, i segnali di calcio registrati vengono analizzati offline.

Con questo metodo, possiamo registrare l'attività di molti recettori alimentari del mais contemporaneamente a risoluzione subcellulare. Questo è il vantaggio principale rispetto alle tecniche esistenti come le registrazioni elettriche a cella singola, che sono più difficili e richiedono molto tempo. Quindi la domanda che vorremmo affrontare è se e come il calcio è coinvolto nella degenerazione dei fotorecettori.

Questo metodo ci permette di determinare se l'afflusso di calcio sta guidando la degenerazione dei fotorecettori o se è il risultato del fatto che la cellula sta morendo. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà principalmente perché la retina sensibile alla luce settimanale deve essere preservata e quindi tutti i passaggi delicati, tra cui la retina, la dissezione e lo slice ion, devono essere eseguiti sotto luce verde e rossa. Per iniziare questa procedura, trasferire un bulbo oculare di topo in una capsula di Petri contenente una soluzione extracellulare ossigenata di carboidrati freschi.

Forare il bulbo oculare in qualsiasi punto lungo il confine tra la cornea e la sclera con un ago da iniezione affilato. Quindi, tieni l'occhio sulla sclera con un paio di pinze e inserisci delicatamente una lama di forbici nel foro. Tagliare lungo l'aura serrata per separare la parte anteriore dell'occhio dalla conchiglia oculare.

Successivamente tagliare l'oculare radialmente nella posizione del segno della penna per indicare la posizione dorsale sulla retina. Quindi posizionare l'oculare in modo che il taglio dorsale sia rivolto verso l'esterno. Afferra la sclera sul lato sinistro e destro dell'oculare inserendo le punte delle pinze tra la retina e la sclera.

Successivamente, staccare la retina invertendo delicatamente la parte sclerale dell'iica. Infine, tagliare il nervo ottico per liberare la retina dalla sclera. Tenere il bordo della retina con un paio di pinze e rimuovere delicatamente i detriti e il corpo vitreo dalla superficie retinica utilizzando un secondo paio di pinze.

Quando la superficie retinica è pulita, eseguire altri tre tagli radiali più corti. Ora immergi lentamente un vetrino nella soluzione extracellulare vicino al tessuto. Tirare delicatamente la retina sul vetrino con un lato delle cellule gangliari rivolto verso l'alto afferrando il bordo per ridurre i danni meccanici e il ripiegamento del tessuto.

Quindi, taglia un rettangolo di circa uno per due millimetri dalla regione retinica selezionata usando una lama di bisturi curva per rimuovere la soluzione in eccesso attorno al tessuto. Quindi posizionare la membrana in fibra di nitrocellulosa pre-preparata sopra il pezzo di retina, in modo che il lato della cellula gangliare aderisca alla membrana. Aggiungere immediatamente una goccia di terreno extracellulare sulla membrana per fissare saldamente il tessuto ad essa.

Trasferire il tessuto retinico montato su membrana nella camera di affettamento contenente una soluzione extracellulare fresca. Quindi tagliare la retina in fette verticali di 200 micrometri di spessore. Utilizzando una colla tritatutto, una singola fetta montata su membrana su un vetrino coprioggetto pre-preparato con grasso ad alto vuoto.

Mantenere la superficie del vetro sotto la retina e priva di grasso. Successivamente, aggiungere una goccia di soluzione extracellulare a ciascuna fetta montata sul vetrino coprioggetto nella camera di mantenimento a temperatura ambiente. Introdurre il carbogeno nella camera facendo gorgogliare un piccolo serbatoio d'acqua e mantenendo l'atmosfera nella camera di mantenimento. Umidificato.

Lasciare riposare le fette nella camera di contenimento per 10-15 minuti prima di trasferirle una ad una nella camera di registrazione. Trasferire una fetta dalla camera di contenimento alla camera di registrazione e iniziare immediatamente a perfonderla con una soluzione extracellulare gassata. Mantenere una portata di perfusione di due millilitri al minuto e una temperatura di 37 gradi Celsius.

Nella camera di registrazione. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua 20 x 0,95 NA e una telecamera CCD in combinazione con un LED a infrarossi sotto la camera di registrazione. Per localizzare la fetta di retina, avviare il sistema di imaging a due fotoni come indicato dal produttore.

Quindi, accendi il laser e impostalo a 860 nanometri. Attivare i due canali di rilevamento per l'imaging a fluorescenza di ECFP e citrino. Successivamente, utilizzando il software di acquisizione delle immagini, controllare il microscopio a due fotoni per la scansione e selezionare una fila di terminali a cono per la registrazione, impostare l'acquisizione delle immagini a 128 x 16 pixel o una configurazione simile, limitare l'area scansionata ai terminali a cono per evitare lo sbiancamento dei pigmenti fotografici nei segmenti esterni.

Accendi il laser. Lasciare che i coni si adattino al laser a scansione e alla luce di fondo dello stimolo per 20-30 secondi prima di presentare stimoli luminosi o applicare agenti farmacologici. Ora inizia la presentazione degli stimoli arbitrari.

Gli stimoli vengono generati modulando l'intensità dei due LED nel tempo, tramite una scheda a microprocessore controllata da un software personalizzato. Quindi avviare la registrazione simultanea dei due canali di fluorescenza utilizzando il rispettivo software di acquisizione delle immagini. Le registrazioni si sono concentrate sui terminali sinaptici dei fotorecettori dei coni nelle fette di retina.

Questo è un esempio di una regione registrata con sette terminali individuali. La fluorescenza è stata registrata utilizzando due canali, uno per il citrino frescettro e uno per il donatore di fret. ECFP. Mostrato. Ecco i cambiamenti di luce evocata nel citrino e nella fluorescenza ECFP registrati in una singola regione di interesse.

Ed ecco le risposte del calcio di un terminale conico a una serie di lampi di luce intensa di un secondo a intervalli di cinque secondi. Questa figura mostra l'analisi quantitativa esemplare delle risposte del calcio dei coni evocati dalla luce. Ed ecco le risposte di calcio evocate dalla luce da un singolo terminale a cono.

Questa figura mostra la determinazione della risposta media del calcio. Il livello di calcio a riposo rappresenta la linea di base prima della stimolazione luminosa e la dimensione della risposta è ra, che è l'area tra il livello di calcio a riposo e l'ampiezza del picco, e tra la cinetica di inizio e offset della risposta. Questa procedura può essere ulteriormente estesa.

Ad esempio, i segnali del calcio dei fotorecettori possono essere importanti in diverse condizioni farmacologiche e di grande stimolazione per indagare come l'adattamento o studiare in dettaglio diverse fasi della fototrasduzione. Questa tecnica permette di studiare la dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni in condizioni fisiologiche normali. E questo è particolarmente rilevante per comprendere la degenerazione primaria e secondaria dei fotorecettori dei coni nelle malattie dell'accecamento umano come l'acro topia o la retinite pigmentosa.