Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo
21 aprile 2023
Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per l'imaging delle risposte del calcio nel collicolo superiore (SC) dei topi svegli, compreso l'imaging dell'attività di un singolo neurone con microscopia a due fotoni, lasciando intatta la corteccia nei topi wild-type, e l'imaging dell'intero SC con microscopia ad ampio campo nei topi mutanti a corteccia parziale.
La mia ricerca si concentra sulla codifica neurale e sui meccanismi per l'elaborazione visiva. Stiamo cercando di rispondere a come le varie informazioni sono codificate nel cervello, in particolare nel collicolo superiore sotto i meccanismi neurologici sottostanti. Per comprendere l'elaborazione visiva, gli scienziati combinano vari approcci, tra cui la morfologia neuronale, il tracciamento anterogrado e retrogrado, il sequenziamento IL, la modellazione neurologica, l'apprendimento automatico.
La sfida è quella di rimuovere il cranio sopra la SSA, tagliando e lasciando nell'osso in un unico pezzo più grande, è probabile che fallisca perché l'osso è attaccato alla dura. Combinando due foto su un'immagine di calcio ad ampio campo, il nostro recente lavoro ha rivelato l'architettura funzionale della direzione del movimento nel topo SC sia a risoluzione singola che su scala globale. Abbiamo scoperto che i neuroni con preferenza simile formano chiazze fino a 500 micrometri sotto il globale verso l'alto sul movimento nasale.
Con il nostro protocollo, stiamo colmando due lacune nella ricerca. In primo luogo, i ricercatori possono eseguire l'imaging a lungo termine in SC di topo con una risoluzione di una singola cellula senza rompere la corteccia. In secondo luogo, i ricercatori possono registrare la neuroattività attraverso l'intero SC utilizzando il microscopio a campo largo.
Il nostro protocollo fornisce una misura per visualizzare lo SC mediale posteriore alla risoluzione di una singola cellula con una corteccia intatta nei topi. Inoltre, utilizziamo un tappo biocompatibile per esporre l'SC, che riduce l'infezione per l'imaging cronico. I nostri risultati forniscono un modo per studiare la codifica neurale delle informazioni visive in un ampio campo visivo.
In combinazione con l'optogenetica, si possono studiare i mezzi input provenienti da diverse regioni cerebrali che modulano la neuroattività in SC.
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Panoramica
Questo studio fornisce un protocollo per l'acquisizione delle risposte al calcio nel collicolo superiore (SC) di topi svegli, utilizzando la microscopia a due fotoni per registrare l'attività di singoli neuroni preservando la corteccia in topi di tipo selvaggio, e impiegando la microscopia a campo ampio per l'intero SC in topi mutanti con corteccia parziale.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Tecniche di Imaging
- Elaborazione Visiva
Sfondo
- Il collicolo superiore svolge un ruolo cruciale nell'elaborazione delle informazioni visive.
- Comprendere il codice neuronale nel SC è essenziale per chiarire i meccanismi dell'elaborazione visiva.
- Metodi di imaging precedenti possono alterare l'integrità corticale, complicando gli studi di registrazione a lungo termine.
- Questo protocollo mira ad affrontare queste sfide fornendo un approccio minimamente invasivo per l'imaging.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per l'immagine del calcio a lungo termine nella SC del topo.
- Facilitare la registrazione dell'attività neuronale in tutta la SC senza alterare la corteccia.
- Migliorare la comprensione di come le informazioni visive siano rappresentate a livello neuronale nella SC.
Metodi Utilizzati
- Lo studio impiega tecniche di microscopia a due fotoni e a campo ampio.
- Vengono utilizzati modelli murini wild-type e mutanti, sfruttando un virus adeno-associato per esprimere GCaMP6m per l'immagine del calcio.
- Le metodologie principali includono l'implantazione di una piastra cranica, approcci chirurgici per esporre la SC e l'uso di una coppetta di aspirazione per l'immagine cronica.
- Dopo l'iniezione virale, viene osservato un periodo di recupero di tre settimane prima di iniziare l'acquisizione delle immagini.
- Passaggi chirurgici dettagliati garantiscono un danno minimo ai tessuti circostanti.
Risultati principali
- Il protocollo consente un'esame dettagliato dell'attività neuronale associata alle preferenze di direzione del movimento all'interno della SC.
- I risultati indicano che i neuroni che mostrano preferenze simili possono raggrupparsi, influenzando l'elaborazione del segnale visivo su aree estese.
- È possibile effettuare un'immagine cronica mantenendo l'integrità corticale, facilitando studi continui sulla dinamica neuronale.
- La combinazione dei dati di immagine con l'optogenetica permette di indagare gli input modulatori provenienti da altre regioni del cervello.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un metodo robusto per analizzare la segnalazione del calcio nella SC, contribuendo in modo significativo alla comprensione dei meccanismi di elaborazione visiva.
- Le tecniche di imaging descritte promettono progressi negli studi longitudinali dell'attività neuronale in animali svegli.
- Queste metodologie miglioreranno l'indagine dei meccanismi neuronali e delle loro implicazioni per il comportamento visivo e i disturbi associati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging del calcio ad alta risoluzione nel collicolo superiore (SC) del topo consente un'analisi diretta del codice neuronale alla base dell'elaborazione visiva, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella fase di validazione del bersaglio. La capacità di registrare sia l'attività a livello di singola cellula che quella dell'intera struttura in animali svegli fornisce un'elevata affidabilità predittiva per i portafogli di neuroscienze traslazionali e neurofarmacologia. Questo approccio su doppia scala rafforza le decisioni nelle fasi iniziali della scoperta e orienta lo sviluppo di saggi successivi per bersagli del sistema visivo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette la mappatura funzionale dei circuiti di elaborazione visiva a livello cellulare e di rete.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica distinguendo la codifica neurale ereditata da quella de novo nella SC.
- Fornisce dati quantitativi sull'attività neurale per guidare la selezione e la validazione degli obiettivi.
- Facilita l'indagine basata su ipotesi relativa alla codifica delle caratteristiche visive in sistemi pertinenti alle malattie.
Screening e sviluppo di saggi
- Consente di stabilire piattaforme di imaging validate per misurazioni riproducibili delle risposte neuronali.
- Fornisce letture quantitative e scalabili adatte al screening di composti nei modelli del percorso visivo.
- Permette la standardizzazione delle condizioni del saggio per garantire confrontabilità tra studi e tra gruppi di ricerca.
- Supporta lo sviluppo di saggi di screening fenotipico robusti per composti neuroattivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le misurazioni dell'attività neurale con biomarcatori traslazionali della funzione visiva.
- Fornisce continuità dalla scoperta del codice neurale alla validazione preclinica di interventi sul sistema visivo.
- Permette l'avanzamento mirato di bersagli del percorso visivo basato su dati funzionali ottenuti in vivo.
- Supporta studi meccanicistici sulla modulazione dei circuiti mediante integrazione optogenetica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di imaging collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, consentendo la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi metabolici e analisi quantitative nel SC. È predisposto per essere integrato dalla validazione del bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e agli studi traslazionali.
- Biologia della scoperta: Permette la misurazione diretta della codifica neuronale e della funzione delle vie nel collicolo superiore.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre dati ad alto contenuto informativo sull'attività neuronale, supportando il confronto statistico tra condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega l'attività neuronale in vivo a potenziali biomarcatori per i disturbi del sistema visivo.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma di imaging riutilizzabile, adattabile ad altre regioni cerebrali e domande di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sui processi visivi.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro di imaging per garantire riproducibilità e scalabilità tra diversi studi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza nell'uso del capitale fornendo dati funzionali solidi già nelle fasi iniziali del percorso.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli del sistema visivo adeguata al rischio e supporta le decisioni di avanzamento con evidenze quantitative.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging in vivo, nella preparazione chirurgica e nell'analisi dei dati.
- Richiede l'accesso a piattaforme di microscopia a due fotoni e a campo largo e all'infrastruttura di supporto.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la gestione degli animali, la somministrazione virale e i protocolli di imaging.
- È adattabile ad altre regioni cerebrali con modifiche ai protocolli, come indicato dalla fonte.
- La stabilità a lungo termine dell'imaging e un targeting preciso sono aspetti pratici da considerare negli studi cronici.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:41
Preparation of a Suction Cup and Plugs for Calcium Imaging in Mouse
4:30
Viral Construct (AAV) Injection in Mouse Superior Colliculus for Calcium Imaging
5:48
Implantation of the Headplate in Mouse for Calcium Imaging
6:40
Implanting the Plug in the Mouse for Calcium Imaging
8:06
Two‐Photon Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
9:37
Wide‐Field Calcium Imaging of Mouse Superior Colliculus Neurons
