Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare la fetta corticale di Calot Thal con quattro strutture uditive principali, il colon inferiore, il talamo uditivo, la porzione uditiva del nucleo reticolare talamico e la corteccia uditiva. Ciò si ottiene rimuovendo prima il cervello dal topo. Il secondo passo è bloccare il cervello in preparazione per l'affettatura.

Successivamente, tagliare il cervello per ottenere fette contenenti la connessione corticale Calot thal. Il passo finale consiste nell'utilizzare l'imaging delle flavoproteine per valutare la connettività. In definitiva, la fetta di cervello contenente la connessione corticale carotale può essere utilizzata per una varietà di esperimenti per comprendere meglio l'elaborazione delle informazioni nelle regioni uditive del cervello medio e quattro La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi per bloccare il cervello prima dell'affettatura sono difficili da apprendere perché richiede un complesso taglio a doppio angolo, che è la chiave per ottenere proiezioni intatte.

A dimostrare la tecnica sarà BJ Slater, uno studente laureato nel mio laboratorio, per preparare la fase di taglio per l'affettatura, tagliare un piccolo pezzo di trivella al 3% di circa un centimetro cubo da utilizzare come antiritorno per il cervello, e un altro pezzo di 1,5 centimetri per 1,5 millimetri per tre millimetri da utilizzare come protuberanza per sostenere il collicolo inferiore. Quindi, incolla il backstop sul palco con adesivo cianoacrilato, quindi incolla la protuberanza sul lato destro del backstop in modo tale da formare un angolo di 80 gradi su una diapositiva contrassegnata da due linee a 90 gradi e una linea diagonale a 17 gradi dall'alto a sinistra al basso a destra. Usando una lama di rasoio, rimuovi da due a quattro millimetri dell'estremità rostrale del cervello per creare una superficie piana.

Quindi, posiziona il cervello con il lato della coccola rivolto verso l'alto sulla superficie piana appena creata. Allineare la superficie dorsale del cervello con una linea orizzontale e la linea mediana del cervello con una linea verticale segnata sul vetrino. Quindi allineare la lama del rasoio con una linea di 17 gradi.

Inclinare il rasoio con un angolo di 30 gradi e rimuovere circa tre millimetri della corteccia destra in un doppio taglio diagonale per montare il cervello sul palco del vibrato. Posiziona un piccolo pezzo di carta da filtro sul lato ventrale del cervello in modo che la dimensione lunga sia perpendicolare alla linea mediana. Applicare con cura una piccola quantità di adesivo cianoacrilato sull'area davanti al dispositivo antiritorno e a sinistra del dosso.

Successivamente, posiziona il lato del cervello tagliato in diagonale sulla colla in modo che la parte coccolare del cervello e il cervello posteriore siano appoggiati sulla protuberanza e il lato destro del cervello sia contro il backstop. In questa procedura, posizionare rapidamente la fase di taglio nel vibrato, costruire una fase con soluzione di taglio. Quindi, allinea la lama con la parte superiore del cervello.

Rimuovere da uno a 1,5 millimetri dalla parte superiore del cervello. Quindi affettare e rimuovere altre fette da 300 a 500 micrometri mentre ci si sposta più in profondità. Quando il collicolo inferiore, il corpo ato mediale e il nucleo ICT laterale sono tutti visibili, il giro dentato dovrebbe apparire a forma di C e la struttura dovrebbe essere allineata.

Ricavare circa due fette da 600 micrometri. Queste sono le fette corticali carotali. Successivamente, trasferiscili nella camera di contenimento a 32 gradi Celsius.

Per acquisire l'immagine dell'autofluorescenza della flavoproteina, raccogliere le immagini a quattro hertz per 105 secondi. Illumina il tessuto con luce blu da 470 a 490 nanometri e cattura oltre i 515 nanometri assicurandoti che l'immagine non sia né troppo scura né spenta. Quindi utilizzare la stimolazione elettrica per attivare il tessuto per acquisire un'immagine del calcio.

Raccogli immagini a 10 hertz per 25 secondi. Illuminare il tessuto con luce a 365 nanometri e catturare la fluorescenza superiore a 510 nanometri. Ancora una volta, assicurandosi che l'immagine non sia né troppo scura né sbiadita.

Quindi utilizzare la stimolazione elettrica per attivare le cellule. Questa immagine mostra la conferma della connessione corticale carotale nella fetta cerebrale mediante l'autofluorescenza della flavoproteina. La stimolazione elettrica somministrata a 0,05 hertz al colon inferiore è stata ripresa a quattro hertz e quattro a elaborata per mostrare la potenza a quella stimolazione.

La frequenza, il talamo uditivo, il talamo, il reticolo, il nucleo e la corteccia uditiva sono attivati sinapticamente. Di seguito è riportata una sezione non connessa. La stimolazione elettrica del colon inferiore con attivazione è stata osservata solo nel talamo uditivo.

L'intero percorso non è stato catturato, probabilmente a causa di uno dei tagli leggermente fuori piano. Con proiezioni corticali di Alam. Questa immagine mostra l'attivazione atipica della corteccia uditiva.

La stimolazione elettrica del colon inferiore attivava la corteccia uditiva senza segnale visibile. Nel talamo uditivo, è probabile che il talamo fosse ancora attivato, ma non era sulla superficie dell'immagine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere la fetta corticale talamica AAL e di valutarne la connettività.