Studiare la Stechiometria di Epidermal Growth Factor Receptor in cellule intatte con correlativa Microscopia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare la distribuzione e la stechiometria dei recettori del fattore di crescita epidermico o EGFR nella membrana plasmatica di cellule intatte e idratate con fluorescenza e microscopia elettronica. Ciò si ottiene coltivando prima cellule che esprimono EGFR come cos seven su microchip con una membrana di nitruro di silicio sottile 50 nanometri che si estende su un'area della finestra situata centralmente. Successivamente, le cellule vengono incubate con una versione biotinilata del fattore di crescita epidermico che si lega al recettore e modifica la conferma dell'EGFR portando alla dimerizzazione e all'attivazione.

Successivamente, le cellule vengono fissate per immobilizzare i recettori e incubate con punti quantici coniugati Hagen spogliati che si legano ai recettori attivati dall'EGF e le cellule vengono sottoposte a un'immagine. Infine, una seconda fissazione con glutaraldeide lega l'abito spogliato in punti quantici coniugati con l'EGFR e stabilizza il campione per la microscopia elettronica. I risultati mostrano una missione di fluorescenza rossa attraverso l'imaging a punti quantici fluorescenti e la distribuzione dell'EGFR e lo stato stechiometrico o il clustering tramite microscopia elettronica a trasmissione a scansione.

Questo metodo fornisce informazioni uniche sulla geometria di riserva e sulla distribuzione dei recettori di membrana nelle cellule intatte e può essere utilizzato per ottenere informazioni sull'attivazione del recettore del fattore di crescita epidermico nelle cellule normali e tumorali. Può anche essere applicato per studiare altri recettori di membrana come i canali ionici Per iniziare mentre si lavora sotto una cappa chimica. Per le prime fasi di preparazione dei microchip con membrana in nitruro di silicio e dopo aver immerso un acetone secondo il protocollo di testo, trasferire i microchip direttamente in un becher di etanolo e attendere due minuti, rimuovere i chip dall'etanolo e posizionarli su un fazzoletto per camera bianca.

Quando le patatine si saranno asciugate, trasferitele su un vetrino precedentemente inserito in una capsula di Petri. Quindi posizionare il coperchio sul piatto. Quindi, posiziona il vetrino con i microchip in un pulitore al plasma.

Eseguire un programma di pulizia standard di cinque minuti per rendere idrofila la superficie della membrana in nitruro di silicio. Quindi, sotto la cappa a flusso laminare, trasferire i microchip dal vetro. Scivolare su un fazzoletto per camera bianca prima di metterli in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti riempita con soluzione di poli-L lisina o incubare PLL per cinque minuti.

Quindi, uno per uno, trasferire i microchip in un secondo pozzetto contenente acqua di grado HPLC prima di risciacquare in un secondo pozzetto d'acqua. Infine, posizionare i microchip singolarmente in pozzetti riempiti di DM di una piastra da 96 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore ad anidride carbonica utilizzando una sottocoltura a sette cellule COS. Preparare una sospensione cellulare monodispersa con una concentrazione di circa cinque volte la 10a.

La quinta cellula per millilitro. Aggiungere una goccia di sospensione cellulare a ciascun microchip nella piastra a parete 96 e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti con un microscopio invertito. Inizia a esaminare le aree dei microchip per ottenere una densità approssimativa da 20 a 30 cos sette celle per finestra di 150 per 400 micrometri.

Quando le cellule hanno aderito a sufficienza, trasferire con cura i microchip con la spaziatura delle celle in nuovi pozzetti contenenti dm. Quando un numero sufficiente di cellule è rimasto aderente, trasferire i microchip con le cellule rivolte verso l'alto in nuovi pozzetti contenenti mmm libero dal siero. Successivamente, incubare i microchip a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica per diverse ore o tutta la notte per i passaggi successivi.

Utilizzando 96, la piastra del pozzetto, riempire i pozzetti con le soluzioni necessarie e utilizzare una colonna del vogatore per microchip. Sciacquare i microchip mettendoli in una fontana con B-S-A-G-E-L-P-B-S freschi e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Trasferisci i microchip in una soluzione di biotina EGF 300 nanomolari e rimettili nell'incubatore per tre minuti perché le cellule inizieranno a emettere l'EGF marcato con EGFR.

Usa rapidamente il PBS per sciacquare i microchip tre volte. Quindi utilizzare un tampone molare 0,1 o CB per risciacquare i campioni. Una volta successivo, trasferisci i microchip in PFA al 3% e incuba per 10 minuti.

Dopo aver risciacquato una volta con CB e tre volte con PBS, trasferire i trucioli in G-L-Y-P-B-S e incubare per due minuti. Quindi utilizzare PBS per risciacquare due volte. Ora, posizionare i microchip in 10 NANOMOLAR S-T-R-Q-D per 10 minuti prima di risciacquare quattro volte con B-S-A-P-B-S.

Quindi immergere un microchip in un piatto di vetro da 35 millimetri con fondo di vetro preriempito con B-S-A-P-B-S a temperatura ambiente per visualizzare le cellule con DIC e microscopia a fluorescenza. Utilizzare un obiettivo ad aria 40 x per immagini panoramiche delle celle etichettate con QD 6 55. Utilizzare un cubo filtrante che eccita i punti quantici tra 340 e 380 nanometri con emissione superiore a 420 nanometri.

Ridurre al minimo l'intensità della luce per evitare due luci intense che potrebbero danneggiare il campione. Impostare il tempo di esposizione su almeno 300 millisecondi in modo che i segnali di tutti i qd vengano acquisiti mentre i lampeggi di fluorescenza QD regolano l'intensità della luce e l'amplificazione per fornire immagini luminose senza rumore visibile dell'immagine, riducendo al minimo l'intensità della luce. Dopo l'imaging, riposizionare il microchip in una piastra a parete 96 con B-S-A-P-B-S.

Sciacquare una volta in cb, quindi trasferire una glutaraldeide al 2% e incubare per 10 minuti dopo l'altro. Wash e CB utilizzare B-S-A-P-B-S per lavare il microchip tre volte conservare in pozzetti preriempiti B-S-A-P-B-S di una nuova piastra a 96 pozzetti per ogni microchip. Riempire una fila di quattro pozzetti con acqua di grado HPLC.

Dopo aver impostato l'ESEM secondo il protocollo di testo, caricare un campione nello stadio STEM ESEM PRE-COOL estraendo la piastra 96 WAT dal contenitore di raffreddamento e posizionandola vicino allo stadio ESEM aperto. Posiziona un fazzoletto per camera bianca accanto ad esso. Sciacquare rapidamente un microchip immergendolo quattro volte per un secondo ciascuna in un pozzo riempito con acqua di grado HPLC.

Tamponare brevemente la parte posteriore del microchip sul tessuto e posizionarlo nello stadio pre-raffreddato con tre microlitri di acqua di grado HPLC raffreddata. Bagnare la superficie del campione e fissare il campione nel tavolino. Quindi posizionare altre tre goccioline d'acqua da tre microlitri sul tavolino vicino al campione e chiudere la camera del campione.

Dopo aver identificato una cellula di interesse, secondo il protocollo di testo, registrare un'immagine panoramica STEM della cellula, spostarsi in una regione periferica di una cellula in cui il bordo della cellula è visibile e ingrandire con un ingrandimento di 50.000 X. Registra le immagini che mostrano i singoli qd e utilizza i tempi di permanenza dei pixel da 20 a 30 microsecondi mostrati qui sono QD 6 55 marcati EGFR legati alla membrana in cellule COS sette intatte e completamente idratate. L'immagine DIC qui illustra la topografia della membrana delle cellule e l'immagine a fluorescenza corrispondente mostra la distribuzione di EGFR su tutta la superficie della cellula dopo tre minuti di incubazione della biotina EGF.

Queste immagini ESEM STEM a basso ingrandimento rivelano strutture sottili come i filopodi che si estendono dalla cellula verso le cellule vicine e alcune strutture all'interno delle regioni cellulari più sottili. Le regioni cellulari centrali spesse, compreso il nucleo, appaiono bianche perché la trasmissione attraverso il campione non è possibile per gli elettroni dell'energia utilizzata. Alta risoluzione.

Le immagini ESEM STEM delle regioni periferiche più sottili mostrano le etichette QD su una piega della membrana che attraversa diagonalmente l'immagine. Questa struttura di membrana ha una densità di EGFR più elevata rispetto alle regioni di membrana circostanti in diverse località, due marcature erano molto vicine. Due esempi con distanze di 20 e 24 nanometri sono indicati con punte di freccia.

Queste coppie di etichette sono interpretate come appartenenti a EGF Fers. Questa immagine è stata registrata di una regione con una densità di EGFR inferiore e un segnale fluorescente. Tuttavia, l'EGFR è stato trovato anche qui nei dimeri ed erano presenti due cluster di 10 o 11 EEG.

Una volta padroneggiata, la preparazione del campione può essere eseguita entro due ore, molto più velocemente rispetto alle tecniche comunemente utilizzate per la microscopia elettronica. Il successivo imaging essem STEM può fornire fino a 100 immagini ad alta risoluzione in mezza giornata.