Cellule staminali simil-

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare espianti del tetto del blastocoele o dell'area animale (animal cap) di x laevis per studiare i meccanismi molecolari e i processi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso in vitro e in vivo. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia dello sviluppo e della biologia delle cellule staminali riguardo all'acquisizione del destino cellulare, alla migrazione cellulare e alle proprietà cellulo-autonome e non autonome delle cellule neurali. Le tecniche presentate offrono strumenti semplici, economici, versatili ed efficienti per esplorare i meccanismi fondamentali che regolano il comportamento delle principali cellule neurali.

Questi saggi permettono il test dei fattori determinanti del destino neurale per la riprogrammazione delle cellule staminali pluripotenti indotte e la generazione matura di cellule derivate neurali per ulteriori analisi di screening. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché le tecniche richiedono abilità manuale. Ebbi per la prima volta l'idea di questi metodi quando stavo pensando di analizzare il comportamento di segregazione cellulare.

Per montare in piano il tubo neurale anteriore di Xenopus laevis, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire un embrione fissato, disidratato e reidratato in una capsula di Petri da 60 millimetri riempita fino all'orlo con PBT. Successivamente, inserire una coppia di pinzette fini tra gli occhi e il tubo neurale al livello del peduncolo ottico e staccare gli occhi. Quindi, introdurre con attenzione le pinzette al di sotto dell'ectoderma sovrastante il tubo neurale dietro la testa e rimuovere con cura l'ectoderma.

Dopo aver eseguito l'ibridazione NC2 con etichettatura appropriata, trasferire l'embrione in una nuova piastra di Petri da 60 millilitri contenente PBT ed utilizzare pinzette fini per isolare grossolanamente il tubo neurale anteriore dall'embrione. Successivamente, rimuovere con attenzione la notocorda, che è debolmente adesa al di sotto del tubo neurale. Se necessario, rimuovere anche le vescicole otiche e le parti rimanenti del mesoderma.

Dopo aver reciso tutti gli appendici del tubo neurale, separare il tubo neurale anteriore dall'embrione. Successivamente, trasferire il tubo neurale isolato in una provetta conica da 1,5 millilitri contenente una soluzione al 50% di glicerolo in PBS, per un trattamento notturno a quattro gradi Celsius. Dopo un secondo trattamento notturno in glicerolo al 90%, trasferire il tubo neurale su un vetrino in una piccola quantità di glicerolo e utilizzare aghi di tungsteno per dissezionare i tubi neurali lungo le linee medie dorsale e ventrale.

Quindi utilizzare anelli di rinforzo ricoperti con un vetrino per montare i due lati del tubo neurale in glicerolo al 90% e PBS. Per preparare le perline per l'induzione di espianti di capsula animale, utilizzare una micropipetta P200 per dividere metà di un aliquota di perline di resina trattate con BSA in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Successivamente, sostituire l'acqua distillata sterile nel nuovo tubo con 200 microlitri di mezzo contenente la molecola sperimentale di interesse per due ore a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, trasferire gli embrioni allo stadio di blastula o di gastrula molto precoce in PBS con calcio e magnesio, integrato con BSA allo 0,2%. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, afferrare la membrana vitellina con il lato di una coppia di pinzette e utilizzare una seconda coppia di pinzette per rimuovere lentamente la membrana dal lato vegetativo dell'embrione, avendo cura di non danneggiare il lato animale. Quindi, utilizzando pinzette fini, asportare un piccolo quadrato dal polo animale di ciascun embrione.

Utilizzando una punta di pipetta rivestita con BSA, trasferire le calotte in singole pozzette di una piastra multiwell Terasaki contenente soluzione salina di Barth modificata 0,5X, posizionando il lato animale pigmentato a contatto con il fondo arrotondato della pozzetta. Con una micropipetta P20, selezionare le perle di colore rosa più scuro dal tubo del trattamento e posizionarne una su ciascuna calotta, utilizzando pinzette per centrare le perle sulle calotte. Una volta posizionata l'ultima perla, posizionare la piastra su carta inumidita con acqua e coprirla con un contenitore di plastica prima dell'incubazione.

Per preparare espianti di calotta animale dissociati e riaggregati, isolare da 15 a 30 calotte animali come appena illustrato. Utilizzare pinzette fini per asportare un piccolo quadrato di tessuto dai poli animali. Trasferire le calotte animali in una pozzetta rivestita di agarosio riempita con soluzione salina di Holtfreter priva di calcio, con le superfici pigmentate rivolte verso l'alto.

Dopo alcuni minuti, si dovrebbe osservare la disgregazione. Utilizzare pinzette fini per separare i livelli pigmentati dal resto del tessuto. Quindi, utilizzare una micropipetta P20 per eliminare il pigmento.

Quando la maggior parte dei livelli pigmentati è stata rimossa e le cellule sono completamente dissociate, ruotare delicatamente la piastra per centrare le cellule ed utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo, avendo cura di non toccare le cellule. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione salina di Holtfreter con calcio nel pozzetto. Trasferire i blastomeri animali dissociati in una provetta da 1,5 millilitro.

Dopo aver centrifugato le cellule, utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in 20 microlitri di soluzione salina di Holtfreter con calcio. Lasciare aggregare nuovamente le cellule per tre-sei ore a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere lentamente un millilitro di 3/4 NAM per staccare delicatamente gli espianti dal fondo del tubo ed utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per distribuire gli espianti in piastre singole non rivestite.

Per trapiantare espianti di cappuccio animale su placche neurali di xenopus laevis, rivestire prima delle capsule di Petri da 60 millimetri con agarosio al 3% e 3/4 NAM, nei quali sono stati praticati dei piccoli fori. Successivamente, trasferire gli embrioni allo stadio di neurula precoce in PBS con calcio e magnesio, integrato con BSA allo 0,2%, per la rimozione della membrana vitellina. Poi riempire la capsula per dissezione rivestita con agarosio con 3/4 NAM fresco e trasferire gli embrioni nella capsula per dissezione con il lato dorsale rivolto verso l'alto.

Ora, trasferire un espianto di calotta animale reaggregata nella piastra per dissezione, permettendo all'espianto di affondare lentamente nel piatto per gravità una volta che la punta della pipetta ha attraversato la superficie del NAM. Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette arrotondate per tenere fermo l'embrione mentre si pratica un'incisione nella placca neurale per l'espianto, usando un ago di tungsteno. Asportare una piccola porzione dell'espianto di calotta animale reaggregata utilizzando pinzette arrotondate e un bisturi per sopracciglia.

Utilizzare il frammento di tessuto per dimensionare un pezzo di espianto destinato al trapianto. Questa figura mostra i tubi neurali anteriori di X laevis e X tropicalis montati in piano come appena illustrato negli stadi 30, 32 e 35 dopo ibridazione doppia in toto con NC2. Come osservato in queste immagini, l'espressione di sonic hedgehog di xenopus viene rilevata nelle cellule a contatto con perline immerse in un mezzo condizionato integrato con l'estremità finale del gene sonic hedgehog, ma non nelle cellule a contatto con perline trattate con mezzo di controllo.

Dopo la dissociazione e la reaggregazione appena descritte, questi espianti contenenti cellule del cappuccio animale anteriorizzate sono stati mescolati con cellule del cappuccio animale anteriorizzate che esprimevano Otx2. Come osservato, queste cellule che esprimevano Otx2 non si sono separate dalle cellule che non esprimevano Otx2. Entrambi i tipi di cellule si sono mescolati liberamente in tutto l'espianto.

Al contrario, negli espianti in cui le cellule esprimenti Otx2 erano mischiate con cellule BAR HL-2, Otx2 e IRX3 esprimenti, le cellule esprimenti più geni formavano aggregati coesivi che non si diffondevano uniformemente all'interno dell'espianto riassemblato. Quando innestati nella placca neurale anteriore di embrioni di x laevis come appena dimostrato, espianti misti composti da cellule che coesprimono BAR HL-2, Otx2 e IRX3 mescolati con cellule esprimenti la porzione N-terminale di sonic hedgehog mostravano espressione endogena di sonic hedgehog e si separavano dalle cellule epiteliali neurali anteriori. Diversamente, quando espianti misti composti da cellule esprimenti Otx2 e la porzione N-terminale di sonic hedgehog venivano innestati nella placca neurale di x laevis, le cellule innestate non esprimevano né sonic hedgehog né si separavano dai loro vicini.

Una volta acquisita padronanza, l'innesto dell'espianto di cappuccio animale su piastre neurali embrionali può essere eseguito in due o tre ore, a seconda del numero di embrioni innestati. Si tratta di una tecnica molto robusta e altamente gratificante. Quando si tenta questa procedura, è fondamentale prestare estrema attenzione alla contaminazione batterica e fungina.

Dopo le procedure di innesto, è possibile eseguire altri metodi come l'ibridazione in situ su preparati interi per seguire il destino e il comportamento delle cellule innestate. I programmi di sviluppo alla base dell'organogenesi del tubo neurale sono ampiamente conservati, specialmente nei vertebrati. Pertanto, le informazioni ottenute negli anfibi hanno approfondito la nostra comprensione dei processi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo dei vertebrati.