Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)
18 agosto 2017
Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.
L'obiettivo generale di questo test immuno-MALDI automatizzato è quantificare i peptidi e le proteine intatte in fluidi biologici complessi in modo accurato e sensibile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della proteomica quantitativa, come quantificare i livelli di proteine per la diagnostica o per monitorare la risposta di un paziente al trattamento. Il vantaggio principale di questo metodo è che può quantificare i livelli di proteine in modo molto sensibile e accurato da campioni complessi.
Questa tecnica consente la diagnosi di malattie in una fase precoce perché la fase di immuno-arricchimento del saggio consente la quantificazione di biomarcatori proteici e peptidici a bassa abbondanza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'attività della renina plasmatica, può essere applicato anche ad altri studi correlati alla malattia, come la quantificazione delle proteine correlate al cancro per la prognosi, la diagnosi e la gestione del trattamento. Per iniziare questa procedura, scongelare i campioni di plasma umano in un bagno d'acqua a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi, posizionare i campioni sul ghiaccio fino a quando non sono completamente scongelati. Successivamente, trasferire manualmente 200 microlitri di ciascun campione di plasma in pozzetti separati di una piastra a pozzetti profonda 1,1 millilitri. Centrifugare la piastra per 10 minuti a due gradi Celsius e 3.000 giri/min.
Quindi, utilizzare Bravo per diluire in serie una soluzione standard di 500 femtomoli per microlitro di Ang-1 NAT per preparare sei soluzioni calibratrici con albumina di albume d'uovo di gallina. Dopo la centrifugazione, pipettare 200 microlitri di ciascun calibratore in un pozzetto e 125 microlitri di tampone di generazione nella piastra del campione. Utilizzando un sistema automatizzato di manipolazione dei liquidi, miscelare 125 microlitri di surnatante plasmatico o 125 microlitri della soluzione di albumina d'uovo di gallina con 25 microlitri di tampone di generazione dell'angiotensina I in una nuova piastra a pozzetti profondi da 1,1 millilitri.
A questo punto, è possibile trasferire automaticamente le soluzioni in una piastra da 96 pozzetti con tre repliche per soluzione e 34 microlitri di soluzione per pozzetto. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore. Per la coniugazione dell'anticorpo con le perle di proteina G, trasferire prima 78 microlitri di liquame di perle precedentemente preparato in una provetta da 1,5 millilitri.
Lavare le perle sette volte con un millilitro di acetonitrile al 25% in PBSC e tre volte con un millilitro di PBSC, utilizzando un supporto magnetico per pellettare le perle tra un lavaggio e l'altro. Dopo aver lavato le perle, risospenderle in 110 microlitri di PBSC e aggiungere 110 microlitri di anticorpo anti-angiotensina I. Mescolare le perle e la soluzione mediante pipettaggio.
Quindi, incubare le perle a temperatura ambiente per un'ora ruotandole a otto giri/min. Successivamente, lavare le perle tre volte con un millilitro di PBSC. Quindi, risospendere le perle in 1, 100 microlitri di PBSC.
A questo punto, trasferire manualmente la soluzione di microsfere in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, fai aliquotare le perle al Bravo sulla stessa piastra a 96 pozzetti. Dopo il periodo di generazione dell'angiotensina I di tre ore, posizionare la piastra di incubazione sul ghiaccio per 10 minuti per terminare la generazione dell'angiotensina I.Diluire automaticamente una soluzione madre di peptidi standard isotopici stabili 100 volte con tampone PBS.
Inoltre, aliquotare automaticamente la diluizione del peptide standard dell'isotopo stabile in una piastra PCR a 96 pozzetti. Trasferire 10 microlitri della soluzione peptidica diluita in ciascun pozzetto della piastra di incubazione. Mescolare la soluzione peptidica diluita con i campioni di plasma o la soluzione di albume d'uovo di gallina.
Aggiungere automaticamente il campione o le soluzioni standard alle soluzioni di microsfere nella piastra di incubazione e mescolare. Dopo un'ora di incubazione, lavare automaticamente le perle tre volte con una soluzione di bicarbonato di ammonio da cinque millimolari. Usa un magnete per tirare le perline verso il fondo dopo ogni lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 10 microlitri della soluzione di bicarbonato di ammonio in ogni pozzetto per risospendere le perle. Trasferire automaticamente sette microlitri di impasto liquido su una piastra target MALDI con una dimensione dello spot di 2.600 micrometri. Una volta che le perle si sono asciugate, aggiungere automaticamente due microlitri di soluzione di matrice HCCA precedentemente preparata dal pozzetto della matrice su ciascun punto del campione sulla piastra di destinazione.
Successivamente, analizzare i punti del campione con uno strumento MALDI-TOF utilizzando la modalità riflettore positivo. Esegui la calibrazione interna, il livellamento dei dati e la sottrazione della linea di base con il software specifico del fornitore. La procedura automatizzata iMALDI per la misurazione dell'angiotensina I consente l'analisi ad alto rendimento di un gran numero di campioni con un coefficiente di variazione intraday inferiore al 10%Qui vengono visualizzati spettri rappresentativi ottenuti misurando l'angiotensina I in campioni di plasma umano.
Qui è mostrata la correlazione dei valori di PRA di 188 campioni di pazienti ottenuti con il test automatizzato iMALDI con i valori di PRA ottenuti utilizzando una procedura clinica LC-MS/MS. I due metodi hanno un coefficiente di correlazione di 0,98 e la differenza tra le pendenze può essere dovuta all'uso di diversi standard interni o di diversi anticorpi. Qui vengono visualizzati l'intervallo lineare del test e la precisione del test.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore. Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di regolare correttamente la testa della punta e la velocità di gestione del liquido. Dopo questa procedura, è possibile utilizzare ulteriori metodi per confermare l'aldosteronismo primario nei pazienti, tra cui il carico orale di sale o i test di infusione salina.
La tecnica automatizzata iMALDI consente lo screening quantitativo specifico e accurato di campioni biologici, compresi i campioni dei pazienti, alla ricerca di proteine o peptidi correlati alla malattia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un saggio iMALDI automatizzato per la quantificazione di proteine e peptidi basata sulla spettrometria di massa. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici, come il plasma umano, è estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione della procedura devono essere sempre prese le necessarie precauzioni di sicurezza.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo per la quantificazione di peptidi e proteine integre in fluidi biologici complessi mediante l'utilizzo della tecnologia immuno-MALDI (iMALDI) automatizzata. Il metodo è stato ideato per fornire misurazioni accurate e sensibili, utili per la diagnostica e il monitoraggio del trattamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Proteomica
- Saggi biologici
- Diagnostica
Sfondo
- La proteomica quantitativa è fondamentale per comprendere i livelli proteici in diverse condizioni.
- La quantificazione di biomarcatori proteici e peptidici a bassa abbondanza può risultare difficoltosa.
- Una diagnosi precoce della malattia può influenzare in modo significativo gli esiti del trattamento.
- Le tecniche automatizzate aumentano la sensibilità e l'accuratezza nella quantificazione delle proteine.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo sensibile e accurato per la quantificazione delle proteine.
- Facilitare la diagnosi precoce delle malattie.
- Fornire informazioni sull'attività reninica plasmatica e sulle proteine associate al cancro.
Metodi Utilizzati
- Tecnologia immuno-MALDI (iMALDI) automatizzata.
- Passaggio di arricchimento immuno per proteine scarsamente abbondanti.
- Scongelamento di campioni di plasma umano per l'analisi.
- Quantificazione di proteine e peptidi in fluidi biologici complessi.
Risultati principali
- Il metodo consente una quantificazione sensibile di proteine da campioni complessi.
- Può essere applicato a diversi studi legati alle malattie.
- La diagnosi di malattia in stadio precoce è facilitata attraverso la misurazione accurata delle proteine.
- È possibile ottenere informazioni sul monitoraggio del trattamento e sulla risposta del paziente.
Conclusioni
- La tecnologia iMALDI automatizzata è uno strumento prezioso nella proteomica quantitativa.
- Il metodo migliora la capacità di diagnosticare precocemente le malattie.
- Fornisce un quadro di riferimento per futuri studi sulla quantificazione delle proteine.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'iMALDI (immuno-MALDI) automatizzato affronta la sfida critica della quantificazione di biomarcatori peptidici e proteici a bassa abbondanza in biofluidi complessi, consentendo un rilevamento sensibile nell'intervallo da ng/mL a pg/mL richiesto per applicazioni cliniche. Integrando l'arricchimento immuno con la spettrometria di massa MALDI-TOF e automatizzando completamente il processo, questo metodo fornisce una quantificazione ad alta produttività e riproducibile, con coefficiente di variazione intra-giornaliero inferiore al 10%, supportando misurazioni affidabili dei biomarcatori nei flussi di lavoro diagnostici e di monitoraggio terapeutico. Questa capacità aumenta l'affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi e nello sviluppo di saggi per indicazioni cardiovascolari, endocrine e oncologiche in cui analiti a bassa abbondanza guidano le decisioni cliniche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando peptidi a bassa abbondanza come l'angiotensina I nel plasma, supportando la validazione funzionale di bersagli rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni specifiche e accurate da campioni complessi, riducendo i falsi negativi nel rilevamento di biomarcatori e migliorando l'affidabilità del bersaglio.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico attraverso una precisa correlazione con parametri clinici come l'attività reninica plasmatica, dimostrata da un valore R=0.98 rispetto a LC-MS/MS.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative e specifiche per massa mediante rilevamento MALDI-TOF, consentendo un confronto preciso dei livelli di analita tra diverse condizioni e campioni.
- Valore operativo: Semplifica la preparazione dei campioni attraverso l'automazione su sistemi di manipolazione liquidi, migliorando la riproducibilità e la produttività per campagne di screening su larga scala.
- Prontezza del saggio: Elimina i passaggi di eluizione, semplificando il flusso di lavoro e riducendo il tempo di manipolazione manuale, mantenendo al contempo la sensibilità per analiti a bassa abbondanza nei fluidi biologici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta l'allineamento con biomarcatori clinici come l'attività reninica plasmatica, consentendo la traduzione dalla fase di scoperta alla validazione preclinica mediante l'uso di intervalli di concentrazione rilevanti per la malattia.
- Avanzamento basato sul rischio: Fornisce dati quantitativi con precisione definita (CV<10%) e linearità, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento o interruzione nell'ottimizzazione del composto leader e nella selezione del candidato preclinico.
- Sistema rilevante per la malattia: Applicabile al plasma umano e ad altri fluidi complessi, garantendo rilevanza fisiologica per studi sui biomarcatori in ambito cardiovascolare, renale e oncologico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo iMALDI si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale del target fino allo sviluppo del saggio e allo screening traslazionale, fornendo misurazioni quantitative di proteine e peptidi che guidano l'identificazione dei composti promettenti e il passaggio alla fase preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la quantificazione sensibile di peptidi segnali e biomarcatori proteici in matrici biologiche native.
- Screening: Fornisce output standardizzati pronti per il saggio con elevata riproducibilità, facilitando la misurazione affidabile degli effetti dei composti negli screening fenotipici o basati su target.
- Analisi: Genera letture quantitative risolte per massa, adatte al confronto statistico e alla correlazione con endpoint funzionali o clinici.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'allineamento dei biomarcatori, come dimostrato dalla quantificazione dell'angiotensina I correlata all'attività della renina plasmatica in campioni di pazienti.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione automatizzata della piattaforma consente il riutilizzo su più target cambiando i coniugati di anticorpi su microsfera, supportando un'implementazione scalabile nei laboratori centrali di proteomica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie al rilevamento sensibile e specifico di analiti a bassa abbondanza in campioni pertinenti alla malattia.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità (CV<10%) e scalabilità mediante automazione, con riduzione della variabilità e aumento della capacità di elaborazione dei campioni.
- Valore strategico: Consente decisioni più informate su prosegui/non prosegui fornendo dati affidabili sui biomarcatori, riducendo l'abbandono biologico in fasi avanzate e migliorando l'efficienza del capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio attraverso misurazioni quantitative allineate alla traduzione, che riflettono l'interazione con l'obiettivo e la modulazione del percorso.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella progettazione di immunoanalisi, nella coniugazione di anticorpi e nell'uso dello spettrometro MALDI-TOF per un'implementazione e risoluzione dei problemi efficaci.
- È dipendente dall'automazione della movimentazione di liquidi, dai sistemi di separazione con microsfere magnetiche e da strumentazione MALDI-TOF dotata di modalità riflettore.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei reagenti, i protocolli di lavaggio e l'applicazione della matrice, al fine di garantire coerenza tra le diverse analisi.
- L'adattamento a nuovi bersagli richiede la validazione della specificità degli anticorpi, dell'efficienza di accoppiamento alle microsfere e dei test di interferenza in matrici biologiche pertinenti.
- I limiti pratici includono il potenziale effetto di soppressione ionica in campioni complessi e la necessità di ottimizzare i passaggi di lavaggio e di trasferimento senza eluizione per ogni coppia analita-matrice.
