Quantificazione delle proteine Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa
31 luglio 2011
Standard di isotopi stabili e cattura da anticorpi anti-peptide (SISCAPA) affinità arricchimento coppie di peptidi con diluizione degli isotopi stabili e spettrometria di massa (MRM-MS) per fornire la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. Qui descriviamo il protocollo utilizzando particelle magnetiche in un formato parzialmente automatizzato.
L'obiettivo generale della seguente procedura è isolare e quantificare peptidi in una miscela complessa che fungono da surrogati per le rispettive proteine. Innanzitutto, le proteine grandi presenti nella miscela vengono digerite in peptidi componenti mediante un enzima come la tripsina. Successivamente, gli analiti peptidici mirati e uno standard interno marcato con isotopo stabile aggiunto vengono arricchiti utilizzando anticorpi anti-peptide, immobilizzati su particelle magnetiche codificate con proteina G dopo l'isolamento.
I peptidi bersaglio vengono eluiti dalle particelle magnetiche e analizzati mediante spettrometria di massa per la quantificazione rispetto allo standard interno. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i tradizionali saggio immunoistochimici, sono la maggiore velocità e convenienza economica nella creazione di un elevato numero di saggi. La tecnica presenta un alto tasso di successo ed è facilmente multiplexabile, come verrà illustrato nella procedura.
Un tecnico in laboratorio ha un campione di 10 microlitri di plasma Eloqua su ghiaccio bagnato. Trasferire il campione in una piastra a pozzetti profondi da 1000 microlitri e coprire con pellicola paraffinata per denaturare le proteine aggiungendo 20 microlitri di urea fresca 9 M e 30 millimolari di DTT a ciascun campione, quindi incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere tre microlitri di iodoacetamide fresca 500 millimolare a ciascun campione e incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Diluire ora l'urea a 0,6 M con tris 100 millimolare a pH 8 e aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre di tripsina da un microgrammo per microlitro, per ottenere un rapporto enzima:substrato di 1:50.
Dopo aver incubato la reazione a 37 gradi Celsius durante la notte, aggiungere tre microlitri di acido formico puro per ottenere una concentrazione finale dell'1%, quindi continuare aggiungendo lo standard isotopico stabile o multipli standard. Se si esegue un saggio multiplex, lavare attentamente la piastra con cartucce Oasis con 500 microlitri di acido formico 0,1% in acetonitrile all'80%, scartando il flusso iniziale. Successivamente, equilibrare la piastra con cartuccia aggiungendo 500 microlitri di acido formico 0,1% in acqua e scartando il flusso iniziale.
Caricare i campioni digeriti sulla piastra della cartuccia e regolare il vuoto in modo che il flusso sia molto lento. Lavare tre volte con 500 microlitri di acido formico 0,1% in acqua e scartare il flusso iniziale. Eluire i peptidi due volte con 500 microlitri di acido formico 0,1% in acetonitrile 80%, quindi liofilizzare o evaporare a secco l’eluito e ricostituire i peptidi secchi in 50 microlitri di PBS contenente 0,03% Chaps. Trasferire i campioni in una piastra standard Kingfisher a 96 pozzetti, aggiungere un microgrammo di anticorpo e 1,5 microlitri di microsferette magnetiche codificate con proteina G per ogni bersaglio. Vortexare le microsferette prima dell’aggiunta.
Per garantire che le perle siano ben sospese, coprire la piastra con della stagnola e incubare tutta la notte con agitazione lenta su un centrifugo rotante. Centrifugare la piastra a 400 giri/min per 10 secondi per rimuovere qualsiasi liquido dalla superficie della stagnola.
Rimuovere il coperchio in foglio di alluminio. La manipolazione del campione avviene su una piattaforma automatizzata Kingfisher. Lavare le perle due volte con 200 microlitri di PBS più 0,03% CHAPS e una volta con 200 microlitri di una diluizione 1:10 di PBS più 0,03% CHAPS, quindi eluire i peptidi con 25 microlitri di acido acetico al 5% più 0,03% CHAPS.
Posizionare la piastra di eluizione su un magnete e trasferire l'eluato in una piastra a 96 pozzetti, avendo cura di non trasferire le perle rimaste. Coprire la piastra con la matrice superiore e consegnare questa piastra contenente l'eluato al triplo o quadruplo spettrometro di massa per l'analisi. Il metodo MRM viene costruito ottenendo uno spettro di massa in tandem del peptide di interesse, quindi selezionando e ottimizzando i migliori ioni frammento di transizione.
Tipicamente, una configurazione per l'analisi MRM utilizza una colonna di trattenuta C 18 e colonne analitiche con due fasi mobili. Caricare 10 microlitri del campione ed eluire mediante un gradiente lineare. Integrare le aree dei picchi per i peptidi leggeri e pesanti e calcolare il rapporto tra le aree dei picchi del peptide non marcato e di quello marcato in ciascun campione.
I peptidi leggeri e pesanti eluiscono contemporaneamente e possono essere monitorate più transizioni per ciascun peptide. Per confermare l'identità, l'area del picco del peptide endogeno viene misurata in rapporto all'area dello standard interno per fornire una misura quantitativa del peptide bersaglio. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come implementare questa tecnica nel vostro laboratorio. Può essere utilizzata per quantificare qualsiasi proteina di interesse, risultando così adatta a un'ampia gamma di applicazioni nella ricerca biologica.
Panoramica
Questo articolo descrive la tecnica SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies), che combina l'arricchimento per affinità di peptidi con la spettrometria di massa con diluizione isotopica stabile per la misurazione quantitativa di peptidi. Il protocollo utilizza particelle magnetiche in un formato parzialmente automatizzato per aumentare l'efficienza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Spettrometria di massa
Sfondo
- SISCAPA consente la quantificazione di peptidi come surrogati delle proteine.
- Il metodo rappresenta un miglioramento rispetto ai tradizionali immunoassay per velocità ed efficacia economica.
- È adatto per saggi multiplex, permettendo l'analisi simultanea di più peptidi.
- La tecnica prevede la digestione delle proteine in peptidi e il loro arricchimento mediante anticorpi specifici.
Scopo dello studio
- Isolare e quantificare peptidi da miscele complesse.
- Illustrare un protocollo che aumenta l'efficienza dell'analisi dei peptidi.
- Fornire un metodo applicabile in modo ampio nella ricerca biologica.
Metodi Utilizzati
- Digestione delle proteine mediante tripsina per generare peptidi.
- Arricchimento dei peptidi bersaglio con anticorpi anti-peptidi su particelle magnetiche.
- Analisi mediante spettrometria di massa per la quantificazione dei peptidi.
- Implementazione di un flusso di lavoro parzialmente automatizzato utilizzando la piattaforma Kingfisher.
Risultati principali
- Il metodo SISCAPA fornisce un'elevata percentuale di successo nella quantificazione dei peptidi.
- Dimostra la capacità di multiplexare efficacemente i saggi.
- Misure quantitative si ottengono confrontando i rapporti tra peptidi leggeri e pesanti.
- La tecnica è adattabile per diverse proteine di interesse.
Conclusioni
- SISCAPA è un metodo robusto per la quantificazione di peptidi in campioni biologici.
- Il protocollo può essere implementato nei laboratori per diverse applicazioni.
- Offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali, rendendolo uno strumento prezioso nella ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione quantitativa delle proteine rimane un collo di bottiglia critico nella validazione degli obiettivi e nella scoperta di biomarcatori, dove i tradizionali saggio immunoanalitici presentano limitazioni in termini di costi, tempi di attesa e interferenze. SISCAPA offre un'alternativa scalabile e multiplexabile che aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, fornendo una quantificazione stechiometrica e indipendente dagli anticorpi di peptidi prototipici. Questo approccio supporta decisioni ponderate sui portafogli di progetti e una continuità traslazionale dall'ipotesi ai modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la quantificazione precisa di proteine bersaglio in matrici complesse.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità meccanicistica utilizzando peptidi proteotipici come surrogati stechiometrici della concentrazione proteica.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio fornendo dati riproducibili e multiplexabili per la priorizzazione dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera protocolli validati di arricchimento di peptidi compatibili con la quantificazione mediante SRM/MRM-MS a valle.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso standard interni con isotopi stabili e arricchimento con microsferette magnetiche.
- Scalabilità: Facilita lo sviluppo di saggi multiplex per la valutazione parallela di bersagli senza deplezione del plasma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica fornendo letture quantitative di peptidi traslabili tra diversi tipi di campioni.
- De-risking meccanicistico: Permette l'allineamento di biomarcatori attraverso la rilevazione specifica e resistente a interferenze di peptidi in sistemi rilevanti per la malattia.
- Conferma predittiva: Supporta decisioni di avanzamento con rischio calibrato mediante misurazioni quantitative di proteine senza l'uso di anticorpi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
SISCAPA si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione dei composti promettenti, consentendo la misurazione quantitativa delle proteine come base per lo sviluppo di saggi e campagne di screening.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici quantificando le proteine bersaglio in contesti biologici nativi.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante arricchimento riproducibile di peptidi e letture quantitative tramite spettrometria di massa per la valutazione dei composti.
- Analisi: Fornisce rapporti tra le aree dei picchi di peptidi leggeri e pesanti come output quantitativi per confrontare condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica grazie alla quantificazione standardizzata di peptidi.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per la quantificazione multiplex di bersagli in diversi progetti e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e avanzamento delle decisioni corretti per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in proteomica, arricchimento basato su anticorpi e spettrometria di massa.
- Presuppone l'accesso a spettrometri di massa dotati di capacità SRM/MRM e a piattaforme per la manipolazione di microsfere magnetiche.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i criteri di validazione degli anticorpi e di selezione dei peptidi.
- Richiede adattamenti in base ai diversi tipi di campione, inclusi plasma, lisati cellulari ed estratti di tessuto.
- Comporta limitazioni pratiche legate alla disponibilità di anticorpi specifici per determinati peptidi e all'efficienza della digestione con tripsina.
