Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans
2 maggio 2018
In questo articolo, dimostriamo live imaging dei singoli vermi che impiegano un dispositivo microfluidico personalizzato. Nel dispositivo, più vermi individualmente sono confinati per separare chambers, permettendo multiplex sorveglianza longitudinale di vari processi biologici.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare longitudinalmente i processi dinamici nei nematodi adulti in condizioni ambientali controllate per il monitoraggio delle risposte comportamentali dei vermi e della cinetica dell'espressione genica dei vermi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come gli animali si adattano ai cambiamenti nel loro ambiente, comprese le differenze nei comportamenti di base, nell'espressione genica, nella memoria e nell'apprendimento. Questa tecnica consente l'osservazione longitudinale multiplex di singoli animali in ambienti controllati dinamicamente, nonché il campionamento simultaneo di molteplici aspetti dell'adattamento ad alta risoluzione.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una comprensione quantitativa dell'adattamento animale, poiché l'acquisizione di dati cinetici ad alta precisione può facilitare la modellazione matematica e la formulazione e la verifica di ipotesi complesse. Per configurare il dispositivo per la procedura, collegare prima la punta della siringa di uscita a un pezzo di tubo siringa di 50 centimetri. Per realizzare un ago adattatore, utilizzare una pinza per estrarre l'albero dell'ago dal mozzo dell'ago di un ago calibro 20 per mezzo pollice e utilizzare un bruciatore Bunsen per rimuovere i residui di plastica rimanenti.
Tenendo entrambe le estremità dell'ago con una pinza, piegare l'ago adattatore in base alla geometria della configurazione sperimentale e inserire l'ago a metà nell'altra estremità del tubo della siringa di uscita. Quindi, collegare una punta della siringa di ingresso del tampone direttamente a una valvola a tre vie e collegare una siringa di ingresso del tampone a un pezzo di tubo della siringa di un metro. Inserendo l'ago adattatore a metà nell'estremità aperta del tubo, collegare la siringa di scambio del tampone a un pezzo di tubo siringa di 50 centimetri tramite la punta della siringa.
Collegare il tubo della siringa alla porta rimanente della valvola a tre vie e chiudere la valvola. Utilizzando un ago adattatore, collegare la siringa di ingresso della vite senza fine a un pezzo di tubo siringa di un metro come appena dimostrato. Quindi, sciacquare tutti i materiali due volte con S-medium e riempire le siringhe e i tubi risciacquati con S-medium fresco, avendo cura di rimuovere eventuali bolle d'aria.
Ora, collegare il tubo della siringa di uscita all'uscita del dispositivo e collegare l'ago adattatore all'estremità del tubo della siringa di uscita alla porta di uscita. Iniettare un piccolo volume di S-medium attraverso l'uscita per riempire il dispositivo fino a quando S-medium non fuoriesce sia dall'ingresso del tampone che da quello della vite senza fine. Collegare il tubo della siringa di ingresso del tampone alla porta di ingresso del tampone del dispositivo e tappare l'ingresso della vite senza fine con una spina di centraggio in acciaio inossidabile con un diametro di un trenta secondi di pollice.
Montare il dispositivo microfluidico su un microscopio a fluorescenza invertito con tavolino motorizzato e fissare una pompa a siringa a un agitatore vicino al microscopio in modo che la pompa non oscilli durante l'agitazione. Quindi, caricare la siringa di ingresso del tampone sulla pompa a siringa e impostare la pompa in modo che fornisca un flusso continuo di S-medium nel dispositivo a una portata di tre microlitri al minuto. Per caricare i batteri nel dispositivo microfluidico, caricare prima una nuova siringa con una sospensione ad alta densità di E.coli OP50.
Ruotare la siringa verticalmente e picchiettare più volte il cilindro per raccogliere tutte le bolle d'aria nella parte superiore della siringa. Spegnere l'agitatore orbitale e chiudere la valvola a tre vie delle siringhe di ingresso del tampone. Sostituire la siringa di ingresso del tampone con la siringa caricata con batteri ed espellere tutta l'aria raccolta nella parte superiore della siringa fino a quando una piccola parte della sospensione batterica non entra nel sistema di scambio del tampone e non rimangono bolle nella siringa caricata con OP50 o nella valvola.
Con la valvola chiusa, collegare la siringa carica di batteri alla pompa a siringa e accendere l'agitatore orbitale. Impostare la velocità di agitazione a circa 200 giri/min e la portata a 100 microlitri al minuto. Una volta che il tampone OP50 si è diffuso in tutto il dispositivo, reimpostare la portata a tre microlitri al minuto.
Per caricare il dispositivo con i nematodi, riempire prima una provetta per microcentrifuga a basso legame da 650 microlitri con 100 microlitri di sospensione OP50 fresca e utilizzare un plettro per trasferire individualmente da 20 a 30 giovani vermi adulti sincronizzati con l'età da una piastra di agar con terreno di crescita per nematodi alla provetta. Riempire la siringa di ingresso del verme e il tubo della siringa con una nuova sospensione OP50 e iniettare circa 500 microlitri di sospensione nella provetta della microcentrifuga. Quindi, aspirare la sospensione del vite senza fine nel tubo della siringa di ingresso del vite senza fine e collegare la siringa di ingresso del vite senza fine all'ingresso del vite senza fine.
Iniettare tutti i vermi attraverso il tubo della siringa di ingresso della vite senza fine nel dispositivo microfluidico e scollegare la siringa di ingresso della vite senza fine e il tubo della siringa. Ostruire l'ingresso della vite senza fine con uno spillo e sganciare la siringa di ingresso del tampone dalla pompa meccanica. Utilizzare la siringa di ingresso del tampone per spostare manualmente i vermi nei canali e la siringa di uscita per invertire il movimento dei vermi, se necessario.
Il caricamento degli animali richiede una certa coordinazione. Spingere delicatamente gli stantuffi della siringa per allinearli con il canale e spingere un po' più forte per spingere il verme fino in fondo. Quindi, lascia che i vermi si adattino al loro nuovo ambiente per due o tre ore prima di iniziare un esperimento.
I vermi sono confinati nei loro canali, ma non sono immobilizzati. La maggior parte dei vermi rimarrà nei propri canali per tutta la durata dell'esperimento, ma alcuni potrebbero sfuggire o rimanere impigliati nelle microfessure. Qui si possono osservare immagini in campo chiaro di un singolo verme rappresentativo nel corso di dieci ore nel dispositivo.
Utilizzando vermi transgenici che esprimono GFP sotto il promotore del gene della risposta immunitaria, dopo l'infezione da PA14 da P.Aeruginosa, l'espressione di GFP viene osservata nella parte centrale e nella coda del verme nelle prime cinque ore di esposizione al patogeno, aumentando fino a una robusta espressione di tutto il corpo nelle successive cinque ore. Il tracciamento della fluorescenza totale di ciascun verme in funzione del tempo post-infezione illustra le dinamiche dell'induzione del gene uno della risposta immunitaria, nonché la variabilità da verme a verme nei tempi e nell'entità dell'induzione. L'imaging time-lapse delle uova deposte dai vermi in ciascun canale consente di tracciare il numero cumulativo di uova deposte da ciascun verme in funzione del tempo post-infezione e cattura la variabilità tra animale e animale, nonché il declino indotto dal patogeno nella deposizione delle uova man mano che l'infezione progredisce.
Una volta padroneggiato, il dispositivo microfluidico può essere preparato e caricato in un'ora. Una volta che il dispositivo è stato caricato e i vermi si sono acclimatati, altri reagenti come farmaci specifici o segnali chimici di interesse possono essere somministrati ai vermi per rispondere a ulteriori domande sul controllo dei sistemi neuronali e genetici dei nematodi. Dopo il suo sviluppo, noi e i nostri collaboratori abbiamo usato questa tecnica per analizzare i comportamenti alimentari dei nematodi e le risposte genetiche dei vermi all'infezione da shock termico e alla fame in una varietà di ambienti.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un dispositivo microfluidico per eseguire saggi longitudinali.
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Panoramica
In questo articolo viene illustrato un metodo per l'acquisizione di immagini in tempo reale di singoli vermi mediante un dispositivo microfluidico personalizzato. Il dispositivo consente un monitoraggio longitudinale multiplex di diversi processi biologici nei nematodi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Studi del comportamento
Sfondo
- Comprendere l'adattamento animale ai cambiamenti ambientali.
- Studiare i comportamenti fondamentali e l'espressione genica nei nematodi.
- Esplorare la memoria e l'apprendimento in risposta a stimoli.
- Utilizzare tecniche di imaging ad alta risoluzione per osservazioni dettagliate.
Scopo dello studio
- Per eseguire l'imaging longitudinale di processi dinamici in nematodi adulti.
- Per monitorare le risposte comportamentali e la cinetica dell'espressione genica.
- Per facilitare la comprensione quantitativa dell'adattamento animale.
Metodi Utilizzati
- Dispositivo microfluidico personalizzato per il confinamento individuale di vermi.
- Acquisizione longitudinale di immagini in condizioni ambientali controllate.
- Campionamento simultaneo di diversi aspetti biologici.
- Tecniche di osservazione ad alta risoluzione.
Risultati principali
- Monitoraggio accurato dei comportamenti dei vermi nel tempo.
- Osservazione dettagliata della dinamica dell'espressione genica.
- Approfondimenti sui meccanismi di adattamento nei nematodi.
- Potenzialità per la modellizzazione matematica dei processi biologici.
Conclusioni
- La tecnica fornisce un quadro per lo studio dell'adattamento animale.
- L'acquisizione dati ad alta precisione facilita la verifica delle ipotesi.
- Questo metodo può migliorare la comprensione delle risposte comportamentali e genetiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi microfluidica longitudinale in Caenorhabditis elegans permette un monitoraggio ad alta risoluzione e multiplex della dinamica comportamentale e dell'espressione genica in condizioni controllate. Questa capacità sostiene una valutazione predittiva affidabile nelle fasi iniziali della scoperta, quantificando la cinetica di adattamento e di risposta a livello singolo animale. L'approccio migliora la riduzione del rischio meccanicistico e orienta la continuità traslazionale per la validazione degli obiettivi e l'analisi dei percorsi biologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Permette un'analisi quantitativa delle risposte adattative a stimoli ambientali o patogeni.
- Consente la validazione funzionale delle target mediante il monitoraggio in tempo reale dell'espressione genica e dei fenotipi comportamentali.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici attraverso osservazioni multiplex e longitudinali su singoli animali.
- Fornisce dati cinetici ad alta precisione per la modellizzazione matematica e la verifica delle ipotesi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara sistemi biologici vitali e validati per flussi di lavoro di screening di composti o genetici successivi.
- Fornisce output standardizzati, riproducibili e quantitativi per saggi comportamentali e di espressione genica.
- Consente un'analisi scalabile e multiplex di più animali in parallelo, pronta per screening robusti.
- Supporta una valutazione affidabile degli effetti dei composti su processi biologici dinamici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla modellizzazione rilevante per le malattie consentendo studi di infezione e risposta allo stress in vivo.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica acquisendo dati longitudinali sull'adattamento.
- Supporta decisioni di avanzamento corrette per il rischio mediante uscite fenotipiche quantitative e risolte nel tempo.
- Migliora la riduzione del rischio predittiva per l'identificazione di biomarcatori traslazionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma di imaging microfluidica si integra nel processo di scoperta, dall'analisi iniziale delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il monitoraggio in tempo reale dell'espressione genica e del comportamento.
- Screening: Fornisce output quantitativi, riproducibili e pronti per saggi, utili per studi su composti o perturbazioni genetiche.
- Analisi: Genera misurazioni cinetiche ad alta precisione e output statistici per il confronto tra condizioni e la modellizzazione.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica modellando in vivo infezione e adattamento.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e adattabile per svariati studi meccanicistici e fenotipici tra diversi team di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del target.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, riproducibili e scalabili per studi longitudinali.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) e l'efficienza del capitale fornendo dati robusti e quantitativi già nelle fasi iniziali della scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione e un avanzamento dei candidati adeguati al rischio, basati su evidenze fenotipiche dinamiche.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microfluidica, imaging in tempo reale e analisi quantitativa dei dati.
- Necessita dell'accesso a microscopia a fluorescenza e alla capacità di fabbricazione o approvvigionamento di dispositivi microfluidici.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per l'acquisizione e l'interpretazione dei dati.
- Adattabile a diversi background genetici e condizioni ambientali in C. elegans.
- Limitazioni potenziali includono la fuga o l'impigliamento degli animali e la necessità di una manipolazione accurata del dispositivo.
