Microscopia di luce-foglio per visualizzazione tridimensionale delle cellule immuni umane

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio come si comportano esattamente le cellule immunitarie in un contesto fisiologicamente rilevante, come cercare le cellule bersaglio in modo efficiente in un ambiente tridimensionale. Il vantaggio principale di questo metodo è quello di generare un foglio di luce molto sottile per illuminare solo il piano focale senza intaccare le celle fuori piano. Ciò consente una velocità di acquisizione molto elevata con una marcata riduzione dello sbiancamento e della fotocitotossicità.

A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Renping Zhao, un post-doc del mio laboratorio. Per iniziare, sotto una cappa di coltura cellulare, trasferire 400 microlitri di soluzione madre di collagene refrigerata in una provetta sterile da 1,5 millilitri. Aggiungere lentamente 50 microlitri di PBS 10X raffreddato.

Quindi mescolare la soluzione inclinando delicatamente il tubo. Aggiungere 48 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 alla soluzione di collagene per regolare il pH da 7,2 a 7,6. Utilizzare strisce reattive per il pH per determinare il valore del pH della miscela.

Aggiungere due microlitri di acqua distillata deionizzata sterile per portare il volume finale a 500 microlitri. Mescolare bene e conservare la soluzione di collagene in ghiaccio o a quattro gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Dopo aver marcato in fluorescenza le cellule vive secondo il protocollo di testo, sotto la cappa di coltura cellulare, trasferire una volta 10 alla sesta cellula in una provetta sterile da 1,5 millilitri.

Centrifugare la provetta a 200 volte g per otto minuti. Quindi scartare il surnatante e utilizzare 200 microlitri di terreno di coltura per risospendere il pellet. Aggiungere 85,9 microlitri della soluzione di collagene neutralizzato alla sospensione cellulare e mescolare correttamente per raggiungere una concentrazione di collagene di 2,5 milligrammi per millilitro.

Lasciare la miscela di collagene cellulare sul ghiaccio nel cappuccio. Quindi, inserire uno stantuffo nel capillare corrispondente fino a quando lo stantuffo sporge di un millimetro dal capillare. Quindi bagnare lo stantuffo immergendolo nel terreno di coltura.

Saltare questo passaggio può comportare l'introduzione indesiderata di bolle d'aria tra lo stantuffo e la matrice di collagene. Immergere il capillare nella miscela di collagene cellulare e tirare lentamente indietro lo stantuffo di 10-20 millimetri. Quindi, con un flacone spray di etanolo al 70%, inumidisci un tovagliolo di carta e usalo per pulire la parete esterna del capillare per rimuovere la soluzione di collagene rimanente.

Ora usa l'argilla da modellare per montare il capillare sulla parete interna di un tubo da cinque millilitri. Spingere la miscela di collagene cellulare fino al bordo del capillare. Quindi incubare il tubo con il capillare a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per un'ora per polimerizzare il collagene.

Dopo l'incubazione, aggiungere uno o due millilitri di terreno di coltura alla provetta. Quindi espellere con cura l'asta di collagene polimerizzato nel terreno fino a quando circa la metà del collagene è appesa nel terreno. Incubare il capillare per altri 30 minuti.

Per eseguire la microscopia a foglio luminoso, assemblare la camera del campione secondo le istruzioni del produttore. Dopo aver acceso il microscopio e l'incubatore se si esegue l'imaging dal vivo, posizionare il capillare nella camera del campione, individuare il campione e trovare l'area di interesse per l'acquisizione dell'immagine. Attiva i laser corrispondenti.

Quindi impostare la potenza del laser e il tempo di esposizione. Impostare anche la dimensione del passo dello stack Z, le posizioni iniziale e finale dello stack Z e l'intervallo di tempo per l'imaging di cellule vive. Quindi avviare l'acquisizione dell'immagine.

Trasferire un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS in una provetta da cinque millilitri sotto una cappa chimica. Quindi immergere il capillare con il collagene polimerizzato nella soluzione di paraformaldeide e utilizzare l'argilla da modellare per montare il capillare sulla parete interna del tubo. Premere delicatamente lo stantuffo fino a quando metà dell'asta di collagene è appesa nella soluzione di paraformaldeide.

Quindi tirare indietro lo stantuffo per riportare l'asta di collagene nel capillare. Rimuovere il capillare dal tubo ed eliminare la paraformaldeide. Montare il capillare in un tubo nuovo e aggiungere un millilitro di PBS.

Assicurarsi che il capillare sia immerso nel PBS. Premere delicatamente lo stantuffo fino a quando metà dell'asta di collagene è appesa nella soluzione e incubare per cinque minuti. Tirare indietro lo stantuffo per raccogliere l'asta di collagene nel capillare.

Quindi sostituire il PBS con PBS fresco ed espellere la bacchetta di collagene nella soluzione. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere uno o due millilitri di tampone di permeabilizzazione bloccante nel tubo. Espellere la bacchetta di collagene nella soluzione e incubare la provetta a temperatura ambiente per 30-60 minuti.

Sostituire il tampone di permeabilizzazione bloccante con 200-500 microlitri di anticorpi primari nel tampone di permeabilizzazione bloccante e incubare il bastoncino di collagene sommerso nella soluzione per un'ora. Dopo aver utilizzato PBST per lavare tre volte il bastoncino di collagene, incubare il bastoncino in anticorpi secondari in tampone di permeabilizzazione bloccante a temperatura ambiente per un'ora. Dopo altri tre lavaggi in PBS, tirare nuovamente l'asta di collagene nel capillare e mantenere il campione in PBS fino all'imaging.

Come si vede in questo filmato, durante la migrazione le cellule CTL trasfettate con una proteina di fusione dell'actina EGFP hanno formato sporgenze maggiori a forma di limone, orlate da sottili strutture simili a fusi. Le traiettorie dei CTL sono illustrate qui con la velocità e la persistenza o lo spostamento diviso per la lunghezza totale del binario come parametri misurati. Le velocità variano da 0,01 a 0,19 micron al secondo con una differenza di quasi 20 volte e la persistenza varia da zero a 0,7.

Questa figura mostra le cellule CTL fissate in gel di collagene 3D colorate per perforina-1 endogena e actina. Il campione è stato illuminato da un solo lato o da entrambi i lati. Da diverse posizioni Z, le cellule sono colorate in modo uniforme, indicando una buona penetrazione degli anticorpi nei gel di collagene.

Il CTL fisso ha mostrato la stessa morfologia delle cellule vive, indicando che la morfologia è ben mantenuta con questo protocollo. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordare di evitare bolle d'aria e di regolare correttamente il valore del pH. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la colorazione di cellule vive con particolari molecole di superficie, per rispondere a ulteriori domande, come correlare il comportamento cellulare con la differenziazione o con diversi sottotipi di cellule o per studiare l'interazione cellula-cellula e il destino cellulare.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare, dell'immunologia e della ricerca sul cancro per esplorare il comportamento cellulare, il destino cellulare, la differenziazione e l'interazione cellulare nel sistema fisiologicamente più rilevante in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni con cellule incorporate in una matrice di collagene tridimensionale, come visualizzare i campioni utilizzando la microscopia a foglio luminoso, dal vivo o fissa, e come monitorare la migrazione cellulare in 3D.