Identificazione dei sottotipi del linfocita usando la formazione immagine tridimensionale fase quantitativa privo di etichetta e Machine Learning
19 novembre 2018
Descriviamo un protocollo per l'identificazione di sottotipi del linfocita usando formazione immagine fase quantitativa e un algoritmo di apprendimento automatico privo di etichetta. Misurazioni dell'indice di rifrazione 3D tomogrammi dei linfociti presentano 3D informazioni morfologiche e biochimiche per le singole celle, che viene quindi analizzati con un algoritmo di apprendimento automatico per l'identificazione di tipi delle cellule.
Questo metodo fornisce un'alternativa all'etichettatura convenzionale della fluorescenza e alla procedura di analisi della citometria del flusso, che richiedono molto tempo, sono costose e corrono il rischio di alterare la funzione cellulare dei campioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è la tomografia tridimensionale dell'indice di rifrazione e l'apprendimento automatico sono metodi quantitativi e senza etichette che consentono un'identificazione dei linfociti rapida e accurata. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dei tumori del sangue e delle malattie autoimmuni in quanto l'identificazione dei linfociti può essere cruciale per la diagnosi delle malattie e un'adeguata applicazione del trattamento.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle popolazioni di linfociti, può anche essere applicato all'analisi di altre singole cellule di interesse, compresi i batteri. La dimostrazione visiva della tecnologia di imaging di fase quantitativa 3D è fondamentale, in quanto facilita una chiara istruzione su come eseguire la tecnica e può fornire informazioni sulle sue applicazioni. Inizia raccogliendo ogni sottoinsieme di linfociti mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza.
Per un'imaging ottimale, diluire ogni campione di cellule a una concentrazione di 180 cellule per microlitro di mezzo RPMI e iniettare lentamente 120 microlitri del primo campione diluito in una camera di imaging. Dopo aver confermato la mancanza di bolle all'interno della camera, posizionare una goccia di acqua distillata sulla lente oggettiva di un microscopio di fase quantitativa 3D e posizionare la camera di imaging sullo stadio di traduzione del microscopio. Regolare lo stage in modo che il campione si allinei all'obiettivo e fare clic sulla messa a fuoco e sulla superficie nella scheda di calibrazione della prospettiva del microscopio del software di imaging per regolare rispettivamente le posizioni assiali delle lenti obiettivo e condensatore.
Fare clic su Modalità automatica per allineare gli obiettivi e gli obiettivi del condensatore. Per ottimizzare l'allineamento, aprire la modalità di scansione e regolare manualmente gli obiettivi per allineare il modello di dispositivo micromirror digitale al centro. Quindi, tornare alla modalità Normale e regolare la fase di traslazione per individuare una cella nel campo visivo.
Regolare la posizione assiale dell'obiettivo per trovare il piano focale fino a quando il limite del campione visualizzato nello schermo è quasi invisibile. È importante regolare perfettamente la messa a fuoco della cella per generare un tomogramma 3DRI ottimale. Se l'immagine non viene scattata correttamente, la ricostruzione 3D sarà compromessa, con conseguente tomogramma rumoroso.
Regolare la fase di traslazione per trovare una posizione senza cella e fare clic su Calibra per misurare più ologrammi 2D con angoli di illuminazione variabili. Regolare la fase di traslazione per individuare una cella al centro del campo visivo. E sotto la scheda Acquisizione, assegnare un nome all'esempio da immagini.
Fare clic su Snapshot 3D per misurare gli ologrammi della cella utilizzando gli stessi angoli di illuminazione degli ologrammi 2D appena misurati. Quando i dati acquisiti vengono visualizzato nel pannello Gestione dati, fare clic con il pulsante destro del mouse sui dati e scegliere Processo per ricostruire un tomogramma indice di rifrazione 3D dagli ologrammi 2D utilizzando l'algoritmo di tomografia di defrazione implementato nel software di imaging. Dopo l'imaging, nel pannello Gestione dati fare clic con il pulsante destro del mouse sui dati e scegliere Apri per visualizzare i dati.
Fate clic sul centro della cella per riposizionarla e fate clic su Tomogramma RI (RI Tomogram) nel pannello Gestione dati . Nella scheda Preimpostato fare clic su Carica e doppio clic su linfocita. xml, che è una funzione di trasferimento predefinita fornita dal software di imaging per visualizzare il tomogramma in base alle distribuzioni 3DRI.
Scorrere il mouse per ingrandire e trascinare la cella per ruotarla in qualsiasi direzione. Per l'estrazione quantitativa morfologica e biochimica, inserire tutti i dati tomografici in un'unica cartella e dividere i tipi di cella all'interno delle singole sottocartelle nella cartella principale. Aprire quindi il file di estrazione delle funzionalità supplementari nel software di imaging appropriato e modificare la riga 14 per designare la cartella del tomogramma da cui devono essere estratti i dati.
Modificare la riga 15 per designare la cartella in cui devono essere salvati i dati della funzionalità estratta ed eseguire il codice. Per ogni tomogramma del set di dati il codice calcolerà l'area della superficie, il volume cellulare, la sfericità, la densità proteica e la massa secca per soglia dell'indice di rifrazione. Per l'apprendimento e l'identificazione supervisionati utilizzare il semplice algoritmo di suddivisione casuale in MATLAB per dividere casualmente i dati delle funzionalità estratte in cartelle separate di training e set di test.
Aprire il file di formazione supplementare e modificare la riga 14 per designare la cartella del set di training, la riga 16 per designare la cartella per il salvataggio del classificatore sottoposto a training e la riga 17 per impostare un nome di file per il classificatore. Quindi eseguire il codice. Utilizzando le funzionalità selezionate del set di training, il codice addestra un classificatore con l'algoritmo K neighbor più vicino e salva il classificatore nella cartella designata.
Aprire quindi il file di test supplementare tre e modificare le righe da 14 a 15 per designare il classificatore addestrato da testare e la riga 17 per designare il set di test addestrato. Quindi eseguire il codice. Il classificatore identificherà i tipi cellulari dei singoli linfociti nel set di test.
Qui vengono mostrati tomogrammi rappresentativi dell'indice di rifrazione resa in 3D di linfociti B, linfociti T positivi CD4 e linfociti T positivi CD8 con diverse combinazioni di colori, assegnati in base ai valori dell'indice di rifrazione assegnati tramite il software di imaging. Dai valori dell'indice di rifrazione è possibile calcolare le caratteristiche morfologiche e biochimiche quantitative. In questo esperimento l'accuratezza della classificazione dei linfociti T e B è stata rispettivamente del 93,15% e dell'89,81% per i casi di allenamento e di prova.
I linfociti T positivi al CD4 e al CD8 sono stati classificati statisticamente e l'accuratezza è stata rispettivamente dell'87,41% e dell'84,38% per i set di training e test. Infine, l'accuratezza del classificatore multiclasse di tipo cella è stata dell'80,65% e del 75,93% rispettivamente per le fasi di training e test. La qualità e il numero di immagini sono essenziali per il successo di questa tecnica.
Migliore è la qualità dell'immagine e maggiore è il volume di dati, migliore è l'accuratezza dell'identificazione. Il deep learning può essere utilizzato per analizzare più completamente i dati complessi dei tomogrammi, migliorando al contempo le prestazioni di identificazione. Inoltre, la fluorescenza e l'imaging di fase quantitativa 3D possono essere utilizzati per studiare il percorso dei ruoli fisiologici dei linfociti identificati.
Dopo il suo sviluppo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare e della biomedicina per esplorare specifiche malattie di interesse all'interno di diversi organismi. In effetti, gli immunologi in particolare possono trarre vantaggio dall'utilizzo di questa nuova tecnologia per identificare la popolazione di interesse.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo senza etichetta per l'identificazione dei sottotipi di linfociti mediante imaging di fase quantitativo combinato con l'apprendimento automatico. La tecnica offre un'alternativa rapida e accurata alla marcatura tradizionale mediante fluorescenza e alla citometria a flusso.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Immunologia
Sfondo
- I metodi convenzionali per l'identificazione dei linfociti possono richiedere molto tempo ed essere costosi.
- La marcatura con fluorescenza può alterare la funzione cellulare.
- La tomografia dell'indice di rifrazione 3D fornisce informazioni dettagliate di tipo morfologico e biochimico.
- L'apprendimento automatico migliora l'accuratezza nell'identificazione dei tipi cellulari.
Scopo dello studio
- Sviluppare una tecnica senza marcatura per l'identificazione dei sottotipi di linfociti.
- Migliorare la velocità e l'accuratezza dell'analisi dei linfociti.
- Esplorare applicazioni nella terapia dei tumori del sangue e delle malattie autoimmuni.
Metodi Utilizzati
- Imaging di fase quantitativa per tomografia dell'indice di rifrazione 3D.
- Algoritmi di apprendimento automatico per l'identificazione del tipo cellulare.
- Ordinamento cellulare attivato da fluorescenza per la raccolta di sottopopolazioni di linfociti.
- Dimostrazioni visive per facilitare la comprensione della tecnica.
Risultati principali
- Il metodo consente un'identificazione rapida e accurata dei sottotipi di linfociti.
- Fornisce informazioni sulle popolazioni di linfociti e altre cellule singole.
- La tecnica è applicabile a diversi campi al di fuori dell'immunologia.
- Le dimostrazioni visive migliorano la qualità didattica del protocollo.
Conclusioni
- Questo metodo senza etichetta rappresenta un notevole progresso nell'analisi dei linfociti.
- Ha potenziali implicazioni per la diagnosi e il trattamento dei tumori del sangue e delle malattie autoimmuni.
- L'approccio può essere adattato ad altri tipi cellulari, ampliandone l'applicabilità.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione senza etichette dei sottotipi di linfociti affronta un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca in immunologia e immuno-oncologia, eliminando la necessità di etichettatura fluorescente, che può alterare la funzione cellulare e introdurre variabilità. Questo metodo consente un profilo fenotipico rapido, quantitativo e riproducibile delle cellule immunitarie a risoluzione singola-cellula, supportando la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nelle fasi iniziali della scoperta. L'integrazione della tomografia dell'indice di rifrazione 3D con l'apprendimento automatico fornisce una piattaforma scalabile per il monitoraggio immunitario in modelli preclinici di tumori ematologici e malattie autoimmuni.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle sottopopolazioni di linfociti senza l'uso di marcatori esogeni, preservando il fenotipo e la funzione nativi per un test accurato delle ipotesi mirate.
- Valore operativo: Riduce la complessità e la variabilità del saggio associata alla colorazione con anticorpi, migliorando la riproducibilità tra laboratori e punti temporali.
- Valore predittivo: Favorisce la validazione funzionale di bersagli immunomodulanti collegando caratteristiche morfologiche e biochimiche all'identità cellulare in un contesto senza marcatori.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera caratteristiche quantitative morfologiche e biochimiche (ad esempio, volume, sfericità, densità proteica) da tomogrammi 3D dell'indice di rifrazione, consentendo la fenotipizzazione multiparametrica delle cellule immunitarie.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi attraverso un contrasto ottico intrinseco, eliminando gli effetti di lotto derivanti dall'etichettatura con anticorpi e dalla variabilità degli strumenti.
- Scalabilità: Compatibile con flussi di lavoro di imaging ad alto contenuto e con pipeline di apprendimento automatico per analisi immunitarie su larga scala in campagne di screening farmacologico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Consente il monitoraggio longitudinale dei sottotipi di linfociti in modelli preclinici di malattia senza alterare la fisiologia cellulare, supportando letture dell'efficacia allineate ai biomarcatori.
- De-risking meccanicistico: Fornisce una validazione senza etichette delle risposte delle cellule immunitarie a candidati terapeutici, riducendo i falsi positivi derivanti da artefatti di marcatura.
- Conferma predittiva: Raggiunge un'accuratezza superiore all'80% nella classificazione multiclasse dei linfociti, favorendo un monitoraggio immunitario affidabile negli studi traslazionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'interazione con la proteina immunitaria all'validazione funzionale, consentendo un monitoraggio immune privo di marcatori tra l'identificazione dell'hit e le fasi di ottimizzazione del composto promettente.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi immunomodulatori fornendo un fenotipaggio quantitativo e senza marcatori delle cellule immunitarie.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi e riproducibili (ad esempio, massa secca, area superficiale) che consentono il confronto degli effetti dei composti sulla morfologia e sulla densità dei linfociti.
- Analisi: Genera set di dati strutturati compatibili con classificatori basati sull'apprendimento automatico, permettendo un'identificazione oggettiva e basata sui dati dei tipi cellulari.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica consentendo il monitoraggio non invasivo della dinamica delle cellule immunitarie in modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di profilazione immunitaria senza marcatori, applicabile in diversi ambiti terapeutici e sistemi modello.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica derivante da artefatti indotti dall'etichettatura.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la capacità analitica grazie a un'immagine standardizzata e priva di marcatori e all'estrazione automatica di caratteristiche.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti fornendo dati affidabili sulla risposta immunitaria, riducendo il rischio di insuccesso in fasi avanzate nei programmi di immuno-oncologia e di malattie autoimmuni.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati immunomodulatori basata su fenotipi cellulari immunitari quantitativi e privi di marcatori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging quantitativo di fase, nella ricostruzione tomografica 3D e nei flussi di lavoro di apprendimento automatico per l'estrazione e la classificazione delle caratteristiche.
- È subordinato all'accesso a un microscopio 3D a imaging quantitativo di fase e a un software in grado di eseguire tomografia dell'indice di rifrazione e visualizzazione della tomografia.
- Necessita di protocolli standardizzati per la preparazione cellulare e l'acquisizione delle immagini, al fine di garantire qualità e riproducibilità della tomografia tra diversi utenti e sedi.
- Richiede l'adattamento delle procedure di estrazione delle caratteristiche a diversi sottoinsiemi di linfociti o sistemi modello in base alle distribuzioni dell'indice di rifrazione.
- È limitato dalla necessità di tomogrammi 3D ad alto quality dell'indice di rifrazione; un fuoco non ottimale o una preparazione del campione inadeguata possono compromettere la ricostruzione e ridurre l'accuratezza della classificazione.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:17
3D Quantitative Phase Imaging
4:34
Quantitative Morphological and Biochemical Feature Extraction and Supervised Learning and Identification
6:42
Results: Representative Label-Free Lymphocyte Subtype 3D Phase Imaging Identification
7:56
Conclusion
