Il TreadWheel: Protocollo di allenamento intervallo per delicatamente indotto da esercizio in Drosophila melanogaster

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca metabolica, come determinare se particolari interventi sullo stile di vita, come l'esercizio fisico, possono giovare a individui specifici. Spesso gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a identificare le larve nel primo stadio di stadio. La chiave è raccogliere larve quasi della stessa dimensione delle uova.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per valutare l'impatto dell'esercizio in molte condizioni sperimentali e genotipi. Innanzitutto, assemblare le camere di posa per ogni gruppo sperimentale. Applicare una cucchiaiata di pasta di lievito su un piatto di agar di succo di mela e fissare il piatto a una bottiglia di plastica da sei once.

Le piastre di agar al succo di mela sono realizzate preparando una soluzione di agar al 3% nel succo di mela acquistato in negozio. E poi riempiendo piatti da 35 per 10 millimetri a 3/4 del muro. La pasta di lievito si ottiene mescolando il lievito secco attivo acquistato in negozio con l'acqua in un rapporto di circa due millilitri di acqua distillata per grammo di lievito.

Tenere la pasta coperta senza stringere per consentire la degassificazione e applicare circa tre cucchiai di millimetro su ogni piastra. La bottiglia, realizzata in polipropilene, deve essere preparata con piccoli fori per l'aerazione. Dopo aver preparato i componenti per la camera, procedere con il caricamento negli adulti.

Una volta che gli adulti del genotipo desiderato sono tutti nella bottiglia, tappare la bottiglia con la piastra e fissare l'assemblaggio con degli elastici. Garantire un numero sufficiente di mosche adulte per le camere di deposizione probabilmente richiede di iniziare a costruire il numero della popolazione diverse generazioni prima dell'esperimento pianificato. Ora, cambia le piastre di agar al succo di mela due volte al giorno, una al mattino e una alla sera.

Quindi lasciare che le uova si sviluppino sulle piastre raccolte per 12-24 ore in larve di primo stadio. Per raccogliere queste larve, usa un pennello sottile o un plettro fatto con un ago sottile flessibile e un manico. Per ogni gruppo sperimentale, trasferire 50 larve di primo stadio in una fiala di cibo fresco e lasciarle sviluppare fino all'età adulta.

Per assicurarti di essere in grado di raccogliere abbastanza larve per ciascuna delle tue repliche, assicurati che ci siano ricercatori disponibili che siano efficienti nel raccogliere le larve al fine di ottenere il numero di cui hai bisogno. Dopo l'impupamento, raccogli le pupe bagnandole prima con un piccolo pennello umido. Quindi raccogliere delicatamente le pupe dai lati dei flaconcini con una spatola.

Caricare le pupe in fiale vuote. Quindi, dopo l'eclosione, trasferire gli adulti in fiale di cibo standard. Da uno a cinque giorni dopo l'eclosione, separare le mosche in base al sesso e dividere ogni sesso in due gruppi, sperimentali e controllati.

Mantenere gli adulti a 50 mosche per fiala. Dare alle mosche fiale fresche con lievito vivo ogni due giorni. Sebbene sia possibile mantenere gli adulti senza l'integrazione di lievito vivo, abbiamo scoperto che gli adulti ottengono prestazioni migliori con l'integratore.

L'integrazione di lievito vivo è una variabile che i ricercatori possono modificare per soddisfare i loro specifici obiettivi di ricerca. Il dispositivo di allenamento utilizza un semplice sistema di cinghie e pulegge alimentato da un motore a velocità variabile. Prima di utilizzare il dispositivo per esercizi, rimuovere eventuali fiale attaccate ad esso e calibrare la velocità del motore utilizzando l'alimentatore in modo tale che un periodo di rotazione completo sia di 15 secondi.

Per cronometrare la velocità di rotazione, collegare un piccolo pennello al coperchio del motore e posizionare la spazzola in modo che tocchi una delle staffe rotanti. Cronometrare quindi il numero di rotazioni effettuate contando i contatti della spazzola e della staffa al minuto. Utilizzando una macchina calibrata, procedere con il primo giorno di esercizio, di solito un lunedì.

Spingere i tappi dei flaconcini nei flaconcini. Lascia le mosche un centimetro di spazio nelle fiale di controllo e sei centimetri di spazio nelle fiale di esercizio. Ora posiziona le fiale nelle pinze e con 10 minuti per far acclimatare le mosche.

Il dispositivo per esercizi può contenere fino a 48 fiale. La temperatura ambiente deve rimanere costante durante la procedura di più giorni o il dispositivo per esercizi può essere inserito in un'incubatrice, se lo si desidera. Il disegno sperimentale consiste in cinque giorni consecutivi di esercizio a settimana.

Ogni giornata di allenamento contiene periodi alternati di esercizio e riposo. In ogni giorno, vengono aggiunti cinque minuti a uno dei periodi di esercizio in modo che su una settimana lavorativa di cinque giorni, tutti e quattro i periodi di esercizio aumenteranno di cinque minuti. Una volta che le mosche si sono acclimatate, inizia il primo periodo di esercizio.

Far funzionare la macchina per 15 minuti. Durante i cinque minuti di riposo tra un periodo e l'altro, lasciare le fiale sulle pinze. Dopo aver completato il quarto ciclo di esercizio, riportare i tappi delle fiale di cibo nelle loro posizioni normali e riportare le mosche nella loro incubatrice.

Per stabilire se l'esercizio sulla TreadWheel ha influenzato i tratti metabolici, l'accumulo di trigliceridi nelle mosche bianche dell'Oregon R e in quelle gialle è stato misurato e normalizzato rispetto alla concentrazione proteica delle mosche. L'analisi statistica ha rivelato un genotipo significativo attraverso l'interazione con l'esercizio che influenza l'accumulo di trigliceridi. C'è stato anche un effetto significativamente dimorfico sessualmente con i maschi che immagazzinavano più trigliceridi rispetto alle femmine.

Le femmine di moscerino esercitato avevano livelli di trigliceridi significativamente più bassi rispetto alle loro controparti non esercitate. Questo non è stato osservato nei maschi. Successivamente, i moscerini sono stati allevati con diete variabili, sottoposti al regime di esercizio fisico e quindi testati su un test di geotassi negativa simile a RING.

Le femmine sono salite significativamente più in alto quando sono state allevate con la dieta ricca di grassi rispetto a qualsiasi altro trattamento. Per i maschi, l'esercizio fisico ha migliorato l'arrampicata solo quando sono stati cresciuti con una dieta normale. Una dieta ricca di grassi non ha avuto alcun effetto.

Curiosamente, c'è stata una diminuzione delle prestazioni di arrampicata dopo l'esercizio per le femmine della linea DGRP 153 quando sono cresciute con una dieta normale. Pertanto, l'esercizio fisico potrebbe non essere un intervento uniformemente positivo per tutti i genotipi. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i dosaggi della glicemia emolinfatica o le analisi della durata della vita, per valutare l'effetto dell'esercizio fisico sul diabete di tipo II o sulla longevità.

Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della genetica e del metabolismo di esplorare il ruolo dell'esercizio fisico nel mantenimento della salute metabolica nell'organismo modello, Drosophila.