Facile protocollo per la sintesi di auto-assemblaggio basato su poliammina Peptide anfifili (PPA) e biomateriali correlate

Questo metodo può rispondere a domande chiave su come decorare gli anfifili peptidici in poliammine e sull'uso di gruppi protettivi ottagonali Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile generare anfifili peptidici ibridi con blocchi chimici non protetti contenenti più lati reattivi. A dimostrare la procedura saranno Mehdi, Nathalia e Krishnaiah, studenti di laboratorio del Conda Sheridan Laboratory. Innanzitutto, pesare attentamente la resina di cloruro di 2-clorotritile e posizionare la resina in un recipiente di sintesi a frittelle di media porocità con una capacità di 50 millilitri.

Quindi, fissare il recipiente della sinetesi a un agitatore meccanico a velocità variabile e ruotare il recipiente a un angolo di 45 gradi per massimizzare l'agitazione. Quindi aggiungere 15 millilitri di DCM alla resina. Dopo aver lasciato gonfiare le perle di resina per 15 minuti, aggiungere otto equivalenti della poliammina desiderata alla resina e lasciarla reagire per cinque ore.

Dopo cinque ore, eseguire un test Kaiser per confermare una reazione corretta della poliammina alla resina. Successivamente, proteggere il gruppo amminico primario aggiungendo quattro equivalenti di DDE in metanolo anidro e agitando la miscela di reazione per una notte. Il giorno seguente, eseguire un test kaiser per confermare l'avvenuta protezione grazie all'assenza di colore blu dal perlo di resina.

Quindi, scolare il DCM e lavare la resina due volte con una miscela due a uno di DCM e DMF. A questo punto, aggiungere alla resina 20 equivalenti di anidride boc in DCM e lasciare che la reazione proceda per tre ore. Dopo aver eseguito un test del cloranil per confermare la protezione dell'ammina secondaria, scolare la miscela di solvente e lavare la resina due volte con una miscela due a uno di DCM e DMF.

Successivamente, aggiungere alla resina 10 millilitri di una soluzione al 2% di idrazina in DMF. Dopo aver agitato per un'ora, eseguire un test kaiser per confermare l'avvenuta deprotezione dell'ammina primaria. Successivamente, mescolare quattro equivalenti dell'amminoacido protetto Fmoc, 3,95 equivalenti di HBTU e 15 equivalenti di DIPEA.

Aggiungere una miscela uno a uno di DCM e DMF e sonicare il cocktail fino alla completa dissoluzione. Assicurati che l'amminoacido, l'agente di accoppiamento e DIPEA siano veramente miscelati e attivati prima di aggiungere la miscela alla resina. Dopo aver atteso da tre a cinque minuti per garantire l'attivazione dell'acido carbossilico, aggiungere la miscela di reazione al recipiente contenente la resina e lasciare che la reazione proceda per due o quattro ore a temperatura ambiente.

Eseguire un test kaiser o cloranile in ogni fase per confermare il corretto accoppiamento. Dopo aver eseguito un test di Kaiser per confermare l'accoppiamento riuscito, deproteggere il gruppo Fmoc dall'amminoacido aggiungendo 10 millilitri di una soluzione al 20% di 4-metilpiridina in DMF. Una volta terminata la reazione, eseguire un test di Kaiser per confermare l'avvenuta deprotezione dell'amminoacido.

Quindi, lavare la resina due volte con 10 millilitri di DMF ogni lavaggio della durata di 5 minuti, e infine con 10 millilitri di DCM per 10 minuti. Dopo aver accoppiato tutti gli amminoacidi richiesti, coniugare la coda idrofobica all'ultimo amminoacido aggiungendo 10 equivalenti della funzionalità dell'acido carbossilico desiderata a 9,5 equivalenti di HBTU e 12 equivalenti di DIPEA. Sonicare il cocktail fino alla completa dissoluzione, quindi aggiungere il cocktail al recipiente.

Eseguire la reazione per almeno cinque ore, anche se è consigliabile eseguirla durante la notte per la massima resa. Lavare la resina con otto millilitri di DMF per due minuti e due volte con otto millilitri di DCM per cinque minuti. Prima di ogni aggiunta, scolare il solvente dal recipiente.

Una volta eseguito l'ultimo lavaggio, asciugare la resina sotto vuoto per 15 minuti. Per preparare 15 millilitri di cocktail di scissione, aggiungere 14 millilitri di TFA a 0,5 millilitri di acqua e 0,5 millilitri di triisopropilsilano. Aggiungi questo cocktail di scissione alla resina e agita per due o quattro ore a temperatura ambiente.

Al termine della reazione di scissione, raccogliere la soluzione in un pallone a fondo tondo da 50 millilitri. Quindi, concentrare il TFA nel vuoto fino a uno o due millilitri utilizzando un evaporatore rotante a pressione ridotta, riscaldando la miscela a 40 gradi Celsius Dopo l'evaporazione, aggiungere la soluzione di TFA ottenuta, goccia a goccia, in un pallone a fondo rotondo contenente 15 millilitri di etere freddo anidro per far precipitare il PPA. Quindi, aggiungere 5 millilitri di etere freddo anidro al pallone originale contenente la soluzione concentrata di TFA.

Sonicare per recuperare solidi aggiuntivi. Quindi, combina con la soluzione di etere del passaggio precedente. Coprite il pallone e mettetelo in frigorifero per una notte per massimizzare le precipitazioni.

Il giorno seguente, raccogliere il materiale precipitato mediante filtrazione sottovuoto utilizzando un imbuto filtrante a disco centrale di dimensioni fini o medie. Infine, lavare il precipitato due volte con cinque-dieci millilitri di etere freddo per rimuovere eventuali residui di sostanze organiche. La traccia HPLC e lo spettro MALDI confermano la presenza del prodotto PPA che dovrebbe avere una purezza superiore al 95% per la caratterizzazione del materiale o la valutazione biologica.

Un singolo picco acuto si osserva nella traccia HPLC a base UV e lo spettro MALDI corrisponde a quello del peso molecolare calcolato del PPA entro più o meno un dalton. L'autoassemblaggio dei PPA può essere visualizzato e analizzato mediante microscopia elettronica a trasmissione, microscopia a forza atomica, diffusione di raggi X a piccolo angolo, microscopia elettronica a scansione e diffusione dinamica della luce. Il successo dell'autoassemblaggio si tradurrà in nanostrutture ben definite, sia nella microscopia elettronica a trasmissione che nella microscopia a forza atomica.

Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in tre giorni se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di purificare i prodotti e di valutarne la purezza prima di qualsiasi studio successivo. Seguendo questa procedura, è possibile preparare altre molecole, come anfifili peptidici, peptidi e ibridi peptide-poliammina.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aiuta la ricerca nel campo degli anfifili peptidici autoassemblanti per esplorare l'influenza delle nanostrutture delle poliammine in aree come la somministrazione di farmaci, l'imaging o la catalisi Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come effettuare la sintesi di anfifili peptidici a base di poliammine e anfifili peptidici correlati. L'acido trifluoroacetico e la 4-metilpiridina possono essere pericolosi e durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere precauzioni come indossare guanti, camici da laboratorio e lavorare nella cappa aspirante.