Sintesi in fase solida Submonomer dei Polimeri Peptoid e il loro self-assembly in altamente ordinato nanosheets

L'obiettivo generale di questo procedimento è descrivere un metodo semplice ed efficiente per la sintesi peptidica in fase solida e l'autoassemblaggio in ambiente acquoso di peptidi in foglietti nanostrutturati altamente ordinati. Strutturalmente simili ai polipeptidi, i peptidi in sostituita glicina sono polimeri in cui le catene laterali sono legate all'azoto piuttosto che al carbonio alfa. Il processo inizia sintetizzando una specifica sequenza peptidica mediante il metodo del sub-monomero.

Il metodo del sub-monomero consiste in due semplici passaggi chimici che introducono ogni monomero nella catena in modo sequenziale. Primo, un'ammina legata a un supporto solido viene bromoacetilata. Secondo, il bromuro viene sostituito con un'ammina primaria.

Questi passaggi vengono ripetuti fino al raggiungimento della lunghezza della catena desiderata. Dopo l'allungamento della catena, il peptide viene scisso dal supporto solido e l'olio grezzo di peptide risultante viene purificato mediante HPLC e caratterizzato per avviare l'autoassemblaggio dei peptide in foglietti nano. Viene preparata una soluzione acquosa diluita del peptide in un tampone all'interno di un vial di vetro e mescolata delicatamente. Come passaggio finale.

Le nanostrutture a foglietto vengono esaminate al microscopio. I risultati dimostrano che un ciclo iterativo di due semplici passaggi chimici può produrre un polimero specifico per sequenza che si autoassembla spontaneamente in nanostrutture a foglietto. I peptidi rappresentano una nuova classe di polimeri ispirati alla biologia, con proprietà intermedie tra quelle delle proteine e dei polimeri tradizionali.

Sono robusti e sinteticamente versatili come i polimeri tradizionali, ma sono anche altamente regolabili e specifici nella sequenza, proprio come le proteine e i peptidi del DNA; questi ultimi stanno emergendo come materiali avanzati per affrontare problemi chiave nella biomedicina e nella scienza dei materiali, come l'identificazione di farmaci bioattivi o la progettazione di proteine artificiali. I principali vantaggi dei peptidi includono un controllo preciso della sequenza, la disponibilità di blocchi costitutivi estremamente diversificati, una sintesi efficiente e la stabilità verso le proteasi. Viene delineato il metodo generale di sintesi manuale dei peptidi, che prevede l'uso di attrezzature di base e reagenti reperibili in commercio, consentendo così la sintesi agevole di peptidi nella maggior parte dei laboratori.

La dimostrazione visiva delle fasi sintetiche è fondamentale e rappresenta un riferimento prezioso per chi si affaccia nel campo della sintesi in fase solida. Per la prima volta, in questo lavoro vengono descritti la purificazione e la caratterizzazione di un peptide anfifilico costituito da 36 residui, nonché il suo assemblaggio spontaneo in foglietti nanostrutturati altamente ordinati. Si inizia il protocollo con l'allestimento dell'apparato sperimentale, come indicato nel protocollo scritto.

I seguenti passaggi verranno eseguiti in un recipiente di reazione in vetro anziché in una cartuccia fritta monouso in polipropilene, per maggiore chiarezza. Dopo aver preparato 100 milligrammi di resina R ammide in un recipiente fritto, far gonfiare la resina aggiungendo due millilitri di dimetilformammide o DMF, agitando mediante gorgogliamento per 10 minuti. Successivamente, rimuovere la soluzione sotto vuoto per isolare la resina gonfia.

Successivamente, aggiungere un millilitro di piridina metilica al 20% in DMF per deprotettare il gruppo FM O. Agitare per due minuti e quindi drenare. Ripetere questo processo per 12 minuti, quindi risciacquare la resina aggiungendo due millilitri di DMF, agitando per 15 secondi e drenando.

Iniziare la sintesi della catena peptidica con il primo ciclo del submonomero, che comprende un'acetilazione bromo e un passaggio di spostamento. Per l'acetilazione bromo, aggiungere un millilitro di acido bromoacetico 0,6 molare in DMF e 86 microlitri di diisopropilcarbodimide. Dopo aver agitato per 30 minuti, drenare e risciacquare con due millilitri di DMF.

Successivamente, eseguire lo spostamento aggiungendo un millilitro di un'ammina da uno a due molarità in endometil pirrogenone e incubare per 30-120 minuti. Al termine dell'incubazione, scaricare e risciacquare con due millilitri di DMF. Proseguire quindi con la crescita della catena peptidica ripetendo il ciclo a sottomonomero. Una volta completato lo spostamento finale, risciacquare con due millilitri di DMF.

Successivamente, applicare un tappo per lavaggio con metano Diora e conservare il reattore fino alla scissione. Per iniziare la scissione, trasferire tutta la resina essiccata in una provetta scintillografica da 20 millilitri, operando all'interno di una cappa e utilizzando idonei dispositivi di protezione individuale; aggiungere quattro millilitri di acido trifluoroacetico, o cocktail di scissione TFA, nella provetta scintillografica e chiudere con un tappo. Mescolare energeticamente per 10 minuti fino a 2 ore a temperatura ambiente.

In alternativa, utilizzare un agitatore rotatorio per mescolare la soluzione. Raccogliere la soluzione di scissione con TFA filtrando la resina attraverso una cartuccia fritta in polipropilene monouso in un nuovo vial di vetro per scintillazione da 20 millilitri precedentemente pesato. Successivamente, aggiungere un millilitro di cocktail di scissione fresco per risciacquare la resina e raccogliere qualsiasi residuo di peptide.

Ripetere questa operazione, risciacquare due volte. Rimuovere l'acido trifluoroacetico (TFA) soffiando una leggera corrente di azoto o utilizzando un evaporatore Biot. Dissolvere l'olio grezzo in sei millilitri di una miscela uno a uno di acetonitrile e acqua utilizzando un evaporatore V 10.

Quindi congelare e liofilizzare il campione. Questo processo deve essere ripetuto una volta in più dopo la seconda liofilizzazione. Registrare il peso del prodotto grezzo e conservarlo come polvere secca a meno 20 gradi Celsius, utilizzando una combinazione di HPLC analitica su colonna e/o spettrometria di massa con ionizzazione a spruzzo elettrospray (LCMS).

La purezza del prodotto grezzo e la presenza del peso molecolare desiderato possono essere determinate seguendo le procedure descritte nel testo. La miscela grezza di peptidi può quindi essere purificata mediante HPLC preparativa in fase inversa secondo la procedura scritta. Questa sezione descrive il protocollo per formare foglietti a partire da una sequenza peptidica specifica di 36 me, anfifilica, a catena singola.

Dopo che il filamento peptidico è stato sintetizzato, purificato e liofilizzato, il residuo bianco risultante viene disciolto in DMSO per ottenere una soluzione madre di due millimolari. Successivamente, preparare un file Dr.Glass da uno per ottenere una soluzione peptidica di 20 micromolari. Per prima cosa, aggiungere 445 microlitri di acqua milli Q e 50 microlitri di buffer per la formazione del foglietto a 10 x.

Vortexare il flaconcino per mescolare. Quindi aggiungere cinque microlitri di una soluzione madre di peptide a due millimolari e lasciare gonfiare delicatamente. I foglietti della soluzione risultante si formano mediante l'agitazione delicata della soluzione acquosa diluita di peptide.

Inclinare lentamente il vial di vetro con tappo dalla posizione orizzontale alla posizione verticale. Provoca un leggero agitamento che produce comunque foglietti, ma questi tendono ad essere più piccoli e con meno bordi dritti rispetto a molti foglietti di alta qualità.

Ruotare lentamente i vial di vetro attorno all'asse orizzontale per un giorno utilizzando un agitatore rotante o un rocker personalizzato per la colorazione fluorescente dei foglietti nano. Aggiungere un microlitro di Nile red 100 micromolare a 100 microlitri di soluzione di foglietti nano per ottenere una concentrazione finale di un micromolare di Nile. Il Nile red è un colorante sensibile all'ambiente il cui intensità di fluorescenza aumenta quando si localizza in ambienti idrofobi. Successivamente, preparare una soluzione di aros all'1% in acqua calda e versarla in una capsula di Petri di plastica.

Assicurarsi che la soluzione di aros abbia uno spessore di circa un ottavo di pollice e lasciare raffreddare la soluzione indisturbata su una superficie piana. Una volta che la soluzione di aros si è solidificata, utilizzare una spatola per tagliare quadrati di un centimetro per un centimetro. Successivamente, trasferire i quadrati tagliati su un vetrino per raccogliere i fogli nello stesso piano e applicare un microlitro di soluzione di fogli su un pezzo di aros.

Dopo due minuti, le membrane dovrebbero assorbire il tampone, lasciando le pellicole in superficie. Acquisire l'immagine della pellicola entro 15 minuti. In alternativa, per acquisire immagini di pellicole e soluzione, caricare 15 microlitri all'interno di una guarnizione di diametro 20 millimetri e spessore 0,12 millimetri su un vetrino.

Coprire il campione con una lamella e acquisire l'immagine entro pochi giorni per eseguire la microscopia elettronica a scansione (SEM) dei nanofogli. Innanzitutto, sottoporre a etching al plasma le chip di silicio per favorire l'assorbimento dei nanofogli. Successivamente, depositare 20 microlitri di soluzione di foglietti peptidici su un substrato di silicio trattato al plasma e lasciare riposare la soluzione; dopo tre minuti, rimuovere la soluzione in eccesso con la punta di un fazzoletto Kimwipe, aggiungere 20 microlitri di acqua sulla superficie e quindi asportare nuovamente la soluzione in eccesso per eliminare tampone e sali.

In alternativa, le soluzioni dei foglietti peptidici vengono dializzate contro acqua per rimuovere il tampone e il sale. In questo caso, 20 microlitri della soluzione di foglietti dializzata possono essere depositati sui substrati di silicio trattati al plasma e lasciati asciugare all'aria. Dopo che la soluzione di foglietti si è asciugata sui substrati di silicio trattati al plasma, il foglietto può essere analizzato mediante SEM utilizzando un rilevatore in lente a energie del fascio comprese tra un chilovolt e cinque chilovolt.

La sintesi, la caratterizzazione e la purificazione di un peptide carico a blocco di 36 me specifico per sequenza, che si ripiega in un foglietto nano bidimensionale altamente ordinato, sono state eseguite. Le ammine utilizzate nella sintesi del peptide carico a blocco di 36 me legano l'etilene diammina al fenetilammina e all'alanina beta t-butilica. Dopo la sintesi, il peptide grezzo è stato scisso dalla resina con TFA acquosa al 95%.

Dopo che la soluzione di TFA è stata raccolta ed evaporata, il peptide grezzo della carica del blocco 36 me è stato purificato mediante HPLC in fase inversa. La massa del peptide della carica del blocco purificato è stata quindi confermata mediante spettrometria di massa.

La massa osservata di 4981,2 corrisponde strettamente alla massa calcolata di 4981,74. La polvere liofilizzata è stata disciolta in DMSO per ottenere una soluzione madre di due millimolari e conservata a quattro gradi Celsius. I campioni sono stati preparati mediante il protocollo sopra descritto e analizzati mediante microscopia ottica a fluorescenza.

Si osservano una varietà di forme con dimensioni caratteristiche fino a 300 micron, e in particolare spiccano bordi dritti. La microscopia elettronica a scansione (SEM) è stata utilizzata anche per ottenere immagini dei fogli, rivelando in modo analogo bordi dritti ben definiti. Questo video descrive un protocollo semplice ed efficiente per la sintesi su fase solida di peptidi e l'autoassemblaggio in ambiente acquoso di peptidi in nanostrutture a forma di foglietto.

Considerando che letteralmente centinaia di amminoacidi sono facilmente disponibili e possono essere utilizzati in questo protocollo, lo spazio di progettazione accessibile con i polipeptidi è praticamente illimitato. I peptidi rappresentano materiali promettenti per la ricerca in biomedicina e nanoscienze grazie alla loro flessibilità sintetica, robustezza e capacità di auto-organizzarsi. A livello atomico in particolare, i nanostrati costituiscono una piattaforma potenziale per impalcature di visualizzazione bidimensionali, sistemi mimetici delle membrane, sensori biologici, mimetici proteici e la fabbricazione di dispositivi.

Il lavoro con reagenti corrosivi come trior, acido acetico e acido bromoacetico è estremamente pericoloso; per prevenire infortuni, eseguire tutte le reazioni in una cappa aspirante e indossare idonei dispositivi di protezione personale.