Meticolosina Sistemi colatori di blocchi biocompatibili per la consegna mirata del DNA plasmide
6 agosto 2019
Questo lavoro presenta la preparazione di copolimeri a blocchi biocompatibili funzionalizzati di methionina (mBG) tramite il metodo RAFT (reversibile addometto-frammentazione a catena di trasferimento). Sono state studiate anche la capacità di complessire il DNA plasmide del mBG ottenuto e la loro efficienza di trasfezione. Il metodo RAFT è molto utile per polimerizzare i monomeri contenenti gruppi funzionali speciali.
I portatori di farmaci polimerici cationici hanno i vantaggi di una buona stabilità, bassa immunogenicità e facile preparazione e modifica. Qui, offriamo un metodo rapido e semplice per la sua sintesi. Il metodo di polimerizzazione reversibile di trasferimento della catena di addizione-frammentazione è un metodo applicabile ai polimeri a blocchi di snervamento con peso molecolare controllato e struttura e che trasportano gruppi funzionali.
Questi portatori di farmaci possono trasportare contemporaneamente diversi farmaci per ottenere il trattamento di collaborazione di cancro, infiammazione e altre malattie. La polimerizzazione IFT è un metodo classico, e questo protocollo fornisce un esempio della sua applicazione nella terapia genica. La chiave del successo per la sintesi di questo polimero è controllare con precisione la temperatura di reazione.
È più consigliabile utilizzare un bagno d'olio che un bagno d'acqua. Per iniziare questa procedura, ottenere un pallone a fondo rotondo con un tappo di gomma e un agitatore magnetico da utilizzare come bottiglia di polimerizzazione. Sciogliere 1,87 grammi di BIS-idrossi HEMA in un millilitro di acqua distillata nella bottiglia di polimerizzazione.
In un bicchiere da cinque millilitri, sciogliere 0,03 grammi di CTP e 0,02 grammi di ACVA in 0,5 millilitri di 1, 4-diossano. Aggiungere questa miscela alla bottiglia di polimerizzazione. Quindi, utilizzare una trappola di condensa per congelare la soluzione nella bottiglia di polimerizzazione.
Fissare la bottiglia al supporto di ferro e utilizzare un condotto inciampato con un ago per aspirare e iniettare azoto nella miscela di reazione. Quindi, sigillare la bottiglia di polimerizzazione e scongelare la soluzione a temperatura ambiente per 30 minuti. Ripetere questo ciclo di congelamento-pompa-scongelamento tre volte.
Successivamente, mettere la bottiglia in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius e lasciare che la soluzione reagisca per 24 ore sotto l'atmosfera di azoto. Il giorno successivo, raffreddare la bottiglia di polimerizzazione a zero gradi Celsius e aprire il tappo di gomma per terminare la reazione di polimerizzazione. Successivamente, preraffreddare l'acetone in frigorifero a -20 gradi Celsius per due ore e mescolarlo con la soluzione di reazione nella bottiglia di polimerizzazione con un rapporto di 50 a uno.
Centrifugare questa miscela a 8.200 volte g per 10 minuti per rimuovere l'acetone e raccogliere il precipitato. Per purificare il poli bis-idrossi idrossi HEMA sintetizzato, sciogliere il precipitato raccolto in due millilitri di acqua pura. Quindi, mescolarlo con 100 millilitri di acetone preraffreddato con un rapporto da uno a 50.
Centrifugare la soluzione a 8.200 volte g per 10 minuti per raccogliere il precipitato. Ripetere tre volte questo processo di purificazione della dissoluzione, miscelazione e centrifugazione del precipitato. In primo luogo, sciogliere 0,96 grammi di APMA e 0,93 grammi del poli bis-idrossiere purificato HEMA in cinque millilitri di acqua distillata in un becher da 10 millilitri.
Sciogliere 0,01 grammi di ACVA in 0,5 millilitri da 1, 4-diossano e aggiungerlo alla soluzione APMA e poly bis-idrossi HEMA. Trasferire questa miscela in una bottiglia di polimerizzazione e ventilare con azoto secco per un'ora. Quindi, metti la bottiglia di polimerizzazione in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius e lasciala reagire per 24 ore sotto l'atmosfera di azoto.
Il giorno successivo, raffreddare la bottiglia di polimerizzazione a zero gradi Celsius e aprire il tappo di gomma per terminare la soluzione del processo di polimerizzazione. Per cominciare, seminare cellule MCF-7 nei pozzi di una piastra di sei po 'ad una densità di 20.000 cellule per pozzo. Coltura delle cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 12 ore.
Successivamente, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di coltura fresco contenente polimero cationico e poliplex pDNA di diverso rapporto tra rapporto azoto-fosforo. Coltura delle cellule per sei ore, quindi sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo RPMI 1640 fresco. Continuare a coltivare per 48 ore.
Quindi, raccogliere le cellule e utilizzare un citometro a flusso per rilevare la fluorescenza verde. In questo studio, i copolimeri a blocchi biocompatibili funzionalizzati alla meionina vengono preparati attraverso il metodo reversibile di trasferimento della catena di addizione-frammentazione e viene studiata la capacità di carnagione del DNA plasmide dell'mBG ottenuto e la loro efficienza di trasfezione. La dimensione media delle particelle e il potenziale zeta dei poliplex mBG/pDNA sono 124 nanometri e più 15,7 millivolt, rispettivamente, con un rapporto N-P di 16.
Il ritardo elettroforetico rivela che il pDNA con un rapporto N-P pari a zero può muoversi senza ritegno nel gel di agarosio ed è osservato come una striscia nell'imager del gel. Quando il pDNA è complesso con mBG, il movimento del pDNA è ritardato e, successivamente, la luminosità della banda viene ridotta. Ciò dimostra che mBG può complessare completamente il pDNA quando la N a P è superiore a quattro.
La citotossicità dei poliplex mBG/pDNA viene quindi misurata utilizzando il saggio MTT standard Questi risultati mostrano che i poliplex mBG/pDNA hanno citotossicità rispetto ai polilessi PEI/pDNA ai rapporti N-p di quattro, otto, 16 e 32. Come si può anche vedere, la citotossicità dei polilessi mBG/pDNA aumenta con un aumento del rapporto N-P. Questo aumento della citotossicità è il risultato del componente GPMA caricato positivamente.
Il rapporto N-P utilizzato nell'esperimento di trasfezione del pDNA viene selezionato in base ai risultati della citotossicità. Le capacità di trasfezione di mBG1, mBG2 e mBG3 vengono confrontate misurando l'intensità di fluorescenza della GFP, e i risultati hanno mostrato che mBG3 è il vettore genico ottimale. È importante esaurire l'aria dal pallone a fondo rotondo del limo e mantenere la temperatura di reazione.
I portatori di farmaci polimerici ottenuti possono essere applicati alla co-somministrazione di farmaci chemioterapici e farmaci genetici per trattare sinergisticamente il cancro resistente ai farmaci. Il meccanismo molecolare di combinazione di farmaci genetici e farmaci chemioterapici può essere ulteriormente esplorato per il trattamento di tumori resistenti ai farmaci. L'acetone è classificato come a bassa tossicità per la sua tossicità acuta.
Le chiavi, l'inalazione o il contatto con gli occhi o la pelle devono essere evitati. Evitare il rischio di scottature durante la procedura di riscaldamento.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo rapido e semplice per la sintesi di polimeri cationici veicoli di farmaci mediante il metodo di polimerizzazione a trasferimento di catena per aggiunta-fragmentazione reversibile (RAFT). I copolimeri a blocchi biocompatibili funzionalizzati con metionina (mBG) sintetizzati sono stati valutati per la loro capacità di complessare DNA plasmidico e per l'efficienza di trasfezione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chimica dei Polimeri
- Terapia Genica
- Sistemi di Somministrazione dei Farmaci
Sfondo
- I polimeri cationici come vettori di farmaci offrono stabilità e bassa immunogenicità.
- La polimerizzazione RAFT consente un controllo preciso del peso molecolare e della struttura.
- Questi vettori possono trasportare più farmaci per un trattamento sinergico.
- Un controllo preciso della temperatura di reazione è fondamentale per una sintesi riuscita.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la sintesi di copolimeri a blocchi biocompatibili.
- Studiare la capacità dei polimeri sintetizzati di complessare il DNA.
- Valutare l'efficienza di trasfezione dei vettori farmacologici.
Metodi Utilizzati
- Polimerizzazione a trasferimento di catena per aggiunta-fragmentazione reversibile (RAFT).
- Sintesi di copolimeri a blocchi funzionalizzati con metionina.
- Valutazione della capacità di complessazione del DNA plasmidico.
- Valutazione dell'efficienza di trasfezione.
Risultati principali
- Il mBG sintetizzato ha dimostrato un'efficace complessazione del DNA plasmidico.
- L'efficienza di trasfezione è stata valutata con successo.
- La polimerizzazione RAFT si è rivelata vantaggiosa per la sintesi di polimeri funzionalizzati.
- Il metodo consente la somministrazione simultanea di più farmaci.
Conclusioni
- Lo studio ha sviluppato con successo un metodo per la sintesi di mBG.
- Questi polimeri biocompatibili mostrano potenzialità per applicazioni nella terapia genica.
- Ulteriori ricerche potrebbero migliorarne l'efficacia nel rilascio di farmaci.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo studio presenta un metodo basato sulla polimerizzazione RAFT per la sintesi di copolimeri a blocchi biocompatibili funzionalizzati con metionina, capaci di complessare DNA plasmidico, offrendo una piattaforma regolabile per lo sviluppo di vettori per il trasferimento genico. La possibilità di controllare il peso molecolare, il rapporto di carica e la dimensione delle particelle consente una progettazione predittiva di vettori non virali con citotossicità ridotta rispetto al PEI, facilitando la riduzione dei rischi nelle fasi iniziali dei terapeutici a base di acidi nucleici. Tali sistemi rispondono alla necessità di una sintesi polimerica scalabile e riproducibile nei flussi di lavoro della scoperta preclinica, in cui la chiarezza meccanicistica e la coerenza formulativa influenzano le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi delle interazioni tra polimeri e DNA mediante la quantificazione della complessazione a rapporti N/P definiti, supportando la validazione degli obiettivi attraverso un rilascio controllato di geni.
- Valore operativo: Fornisce un percorso sintetico riproducibile per copolimeri a blocchi cationici con funzionalizzazioni regolabili di metionina e guanidina, riducendo la variabilità nei saggi di screening iniziali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera poliplessi ben definiti con potenziale zeta misurabile (+15,7 mV a N/P 16) e dimensione (124 nm), consentendo una valutazione standardizzata dell'efficienza di trasfezione e della citotossicità.
- Valore operativo: Facilita lo screening ad alto rendimento di varianti polimeriche (mBG1, mBG2, mBG3) collegando il contenuto di APMA (21%, 37%, 52%) agli esiti funzionali nei saggi di trasferimento genico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra il completo arresto del DNA plasmidico a N/P >4, indicando una protezione affidabile del carico utile, un parametro fondamentale in ambito preclinico per la stabilità del vettore.
- Valore operativo: Permette la valutazione di diverse formulazioni a diversi rapporti N/P (8, 16, 4) al fine di identificare le condizioni ottimali di trasfezione, monitorando al contempo le tendenze di citotossicità associate al contenuto di GPMA.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la sintesi di vettori genici definiti per l'identificazione di composti promettenti nella somministrazione di acidi nucleici, in cui le relazioni struttura-funzione dei polimeri guidano le decisioni di sviluppo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul trasferimento genico mediato da polimeri fornendo output quantificabili (dimensione delle particelle, potenziale zeta, efficienza di trasfezione) per correlare struttura e attività biologica.
- Screening: Permette la produzione di poliplessi pronti per il saggio con dimensioni costanti (100–200 nm a rapporto N/P 16–32) e carica superficiale uniforme, migliorando la riproducibilità durante le campagne di valutazione dei composti.
- Analisi: Genera letture biofisiche misurabili (rapporto N/P, potenziale zeta, ritardo elettroforetico) che consentono l'analisi comparativa di varianti polimeriche in condizioni standardizzate.
- Ricerca traslazionale: Collega la progettazione del polimero a rilevanza preclinica dimostrando la complessazione del pDNA e una citotossicità ridotta rispetto al PEI, sostenendo un avanzamento proporzionato al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma modulare basata su RAFT adattabile ad altri aminoacidi funzionali o terapie, promuovendo la standardizzazione trasversale ai progetti nella sintesi polimerica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle prestazioni dei vettori genici collegando la progettazione molecolare (contenuto di metionina/guanidina) ai risultati di legame del DNA e di trasfezione.
- Valore operativo: Fornisce un protocollo di sintesi scalabile e favorevole alla purificazione, che utilizza la precipitazione con acetone e il controllo RAFT, migliorando la coerenza tra un lotto e l'altro.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico in fase avanzata offrendo un'alternativa a minore citotossicità rispetto al PEI, consentendo decisioni più accurate su prosegui/non prosegui nello sviluppo di terapie a base di acidi nucleici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei polimeri promettenti in base a profili di sicurezza ed efficienza di trasfezione, con un adeguamento al rischio (ad esempio, mBG3 come vettore ottimale).
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella polimerizzazione RAFT, inclusa la degasificazione mediante cicli di congelamento-pompa-scongelamento e la manipolazione in atmosfera inerte.
- È dipendente da un controllo preciso della temperatura (bagno d'olio a 70°C) e da reagenti specializzati (ACVA, CTP) per la sintesi riproducibile di copolimeri a blocchi.
- Necessita di infrastrutture analitiche per GPC, potenziale zeta, dimensionamento delle particelle e saggi di trasfezione basati sulla fluorescenza per valutare le prestazioni dei poliplessi.
- L'adattamento ad altre linee cellulari o carichi potrebbe richiedere una nuova ottimizzazione del rapporto N/P e la valutazione della citotossicità a causa degli effetti variabili mediati dal GPMA.
- I limiti pratici includono la necessità di una purificazione in più passaggi e la sensibilità all'ossigeno durante la polimerizzazione, che devono essere mitigati mediante protocolli rigorosi di degasificazione.
