Combinazione di microdissezione laser di cattura e qPCR microfluidico per analizzare i profili trascrizionali di singole cellule: un approccio di biologia dei sistemi alla dipendenza da oppioidi
8 marzo 2020
Questo protocollo spiega come raccogliere singoli neuroni, microglia e astrociti dal nucleo centrale dell'amigdala con alta precisione e specificità anatomica utilizzando la microdissezione di cattura laser. Inoltre, spieghiamo il nostro uso di RT-qPCR microfluidico per misurare un sottoinsieme del trascrittoma di queste cellule.
Questo è un metodo altamente accurato ed economico per comprendere l'espressione genica a livello di singola cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo montare 96 campioni in un unico lotto. Questo alto numero di campioni ci permette di identificare sottofenotipi cellulari con una specificità anatomica.
La pipeline di questo metodo può essere applicata a qualsiasi problema biologico, qualsiasi sistema, qualsiasi tessuto, al fine di informarsi sulla risposta cellulare individuale dei singoli neuroni o altri tipi di cellule alla malattia o a qualsiasi altro disturbo, qualsiasi funzione. E poi vai oltre e chiedi se quelle risposte cellulari hanno un'architettura anatomica. Rimuovere il cervello dalla scatola di raccolta dei tessuti e posizionarlo sul mandrino criostato.
Raccogliere 10 sezioni di micron contenenti il nucleo centrale dell'amigdala o di un'altra regione cerebrale preferita scongelando il montaggio di sezioni da 10 micron su vetrini semplici. Posizionare immediatamente gli scivoli di vetro su una padella metallica appoggiata su ghiaccio secco. Metti le diapositive con sezioni cerebrali in un congelatore meno 80 gradi Celsius il prima possibile.
Per eseguire una serie di disidratazione di etanolo e xilene, immergere prima le diapositive nel 75% di etanolo per 30 secondi. Subito dopo, immergere le diapositive nel 95% di etanolo per 30 secondi. Quindi immergere le diapositive nel 100% di etanolo per 30 secondi.
Infine, immergere le diapositive direttamente in un secondo contenitore di 100%etanolo per 30 secondi. Dopo la serie di disidratazione dell'etanolo, immergere le diapositive in xilene appena versato per un minuto. Immediatamente dopo, immergere le diapositive in un secondo contenitore di xilene per quattro minuti prima dell'asciugatura come descritto nel protocollo di testo.
Utilizzare la fluorescenza per identificare il tipo di cella macchiata e il suo nucleo nella regione di interesse. Scegliere una cella o più celle se si esvengono esati campioni in pool a cella singola. Contrassegnare le celle di interesse utilizzando la microdisezione di acquisizione laser o il software LCM.
Posizionare il cappuccio LCM sopra la fetta sulla regione di interesse e sciogliere l'adesivo del cappuccio LCM sull'area della singola cella selezionata come descritto nel protocollo di testo. Selezionare le singole celle da raccogliere per l'analisi utilizzando gli strumenti software LCM. Le cellule selezionate devono essere nell'area anatomica del nucleo centrale dell'amigdala in base all'atlante cerebrale del ratto e al bregma.
Le cellule devono essere almeno tre micron dai nuclei macchiati adiacenti. Quindi spara il laser a infrarossi per raccogliere le singole cellule identificate. Posizionare il cappuccio nella stazione QC e visualizzarlo per assicurarsi che siano state selezionate solo le celle desiderate.
Se altre cellule sono state erroneamente selezionate, un laser ultravioletto può essere utilizzato per distruggere le cellule indesiderate mentre il cappuccio rimane nella stazione QC. Scatta una foto della sezione tissutale da cui è stata raccolta la cellula per documentarne la specificità anatomica. Registrare la distanza della fetta dal bregma, se appropriato, utilizzando un atlante cerebrale del ratto come riferimento.
Rimuovere il tappo LCM dalla stazione QC e collegare il dispositivo di estrazione del campione. Quindi pipettare 5,5 microlitri di tampone di lisi sul campione. Montare il dispositivo di estrazione su un tubo di microcentrifugo da 0,5 millilitri e posizionarlo su una piastra calda a 75 gradi Celsius per 15 minuti.
Far girare il campione e il tampone dilisi per 30 secondi a bassa velocità e posizionare il campione raccolto in un congelatore meno 80 gradi Celsius. Per eseguire la pre-amplificazione dell'mRNA a singola cella per un chip array dinamico, aggiungere prima cinque microlitri di 5X VILO a ciascun pozzo di una nuova piastra PCR 96 per 96. Rimuovere campioni di singole celle LCM da meno 80 gradi Celsius e lasciare che si scongelino brevemente.
Dopo la centrifugazione a bassa velocità, aggiungere 5,5 microlitri dei campioni a singola cella llysed alla piastra PCR aggiungendo ogni campione al proprio pozzo. Posizionare la piastra PCR con i campioni e VILO nel termociclo e riscaldare a 65 gradi Celsius per un minuto e mezzo. Quindi ruotare la piastra per un minuto a 1,300 volte g e quattro gradi Celsius e posizionare la piastra sul ghiaccio.
Aggiungere 10X cDNA synthesis master mix, T4 Gene 32 Protein e DNA suspension buffer ad ogni pozzo. Posizionare la piastra PCR che è la piastra campione uno nel termociclo e correre come descritto nel protocollo di testo. Dopo il ciclo, aggiungere nove microlitri di soluzione di Taq polimerasi ad ogni pozzo nella piastra PCR da 96 po '.
Nove microlitri sono costituiti da 7,5 microlitri di mix principale di Taq polimerasi e 1,5 microlitri del pool di primer. Ora, posizionare la piastra PCR nel termociclo ed eseguire il programma di pre-amplificazione dettagliato nel protocollo di testo. Seguendo il protocollo di pre-amplificazione, aggiungere sei microlitri di soluzione di esonucleasi ad ogni pozzo nella piastra PCR da 96 po '.
La soluzione di esonucleasi è costituita da 0,6 microlitri di tampone di reazione 10X exonuclease-one, 1,2 microlitri di esonucleasi-uno e 4,2 microlitri di tampone di sospensione del DNA. Posizionare la piastra PCR nel termociclo ed eseguire il programma elencato nel protocollo di testo. Infine, aggiungere 54 microlitri di tampone TE a ciascun pozzo della piastra campione uno.
Ruotare la piastra PCR a 1.300 volte g per cinque minuti. Conservare a quattro gradi Celsius se si continua immediatamente al passaggio successivo. In una nuova piastra PCR da 96 po' che è la piastra campione due, aggiungere cinque microlitri di colorante legante dna e soluzione master mix.
Aggiungere tre microlitri di campioni preamplificati dalla piastra campione uno nei pozzi corrispondenti nella piastra campione due. Ruotare la piastra PCR a 1.300 volte g e quindi mettere la piastra sul ghiaccio. In una nuova piastra PCR da 96 po ' che è la piastra di dosaggio due, aggiungere cinque microlitri di soluzione di caricamento del test ad ogni pozzo.
La soluzione di caricamento del saggio è costituita da 3,75 microlitri di reagente di carico del saggio 2X GE e 1,25 microlitri di tampone di sospensione del DNA per pozzo. Quindi aggiungere 2,5 microlitri di primer qPCR micromolare dalla piastra di dosaggio uno al suo pozzo corrispondente nella piastra di dosaggio due. Ruotare la piastra PCR a 1.300 volte g per cinque minuti.
Per caricare ed eseguire il chip dell'array dinamico, prima innescare il chip con fluido della linea di controllo. Quindi posizionare il chip in un controller IFC HX ed eseguire lo script 136X principale. Aggiungere sei microlitri dalla piastra campione due nei pozzi campione corrispondenti nel chip array dinamico 96 per 96.
Ora, aggiungere sei microlitri dalla piastra di dosaggio due nei pozzi di dosaggio corrispondenti nel chip array dinamico 96 per 96. Usa gli aghi per far scoppiare eventuali bolle d'aria nei pozzi del chip array dinamico 96 per 96. Quindi posizionare il chip nel controller IFC HX ed eseguire lo script 136X del load mix.
Rimuovere quindi il chip dal controller IFC HX. Posizionare il chip di array dinamico 96 per 96 in una piattaforma RT-qPCR microfluidico ed eseguire il protocollo PCR GE fast 96 by 96. La selezione delle singole cellule è stata convalidata sia visivamente che molecolarmente. Visivamente, la morfologia cellulare è stata vista prima della raccolta cellulare.
Qui sono mostrate immagini rappresentative di una diapositiva con forebraina del ratto emisferata contenente il nucleo centrale dell'amigdala. Immagini successive mostrano la selezione di singole cellule e la loro rimozione dal tessuto per l'analisi trascritomica. Molecolarmente, marcatori specifici del tipo di cellula hanno dimostrato una maggiore espressione nel loro rispettivo tipo di cellula.
In particolare, una maggiore espressione di NeuN è stata osservata nei neuroni, Maf in microglia e Gfap negli astrociti. La mappa termica mostra l'espressione di tutti i campioni in 40 geni analizzati. Le file sono campioni raggruppati a trazione, i numeri denotano gli ammassi campione e le colonne sono i geni.
I metodi di analisi multivariata mostrano che gli astrociti nel gruppo di prelievo erano il tipo di cella più colpito. Sulla base di questi dati nel contesto di altri studi, gli astrociti svolgono probabilmente un ruolo chiave nell'infiammazione nel nucleo centrale dell'amigdala durante il ritiro degli oppioidi. La cosa più importante da ricordare di questa tecnica è usare una pipettazione corretta per limitare il numero di bolle d'aria.
I risultati trascrittivi di questi esperimenti possono essere convalidati utilizzando metodi di misura proteica come l'immunofluorescenza o la macchia occidentale sullo stesso tessuto.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per raccogliere singoli neuroni, microglia e astrociti dal nucleo centrale dell'amigdala con elevata precisione mediante microdissezione laser assistita. Inoltre, illustra l'applicazione della RT-qPCR in microfluidica per analizzare il trascrittoma di queste cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Espressione genica
Sfondo
- Comprendere l'espressione genica a livello di singola cellula è fondamentale per la ricerca in neuroscienze.
- Un'elevata capacità di analisi del campione consente l'identificazione di sottotipi cellulari.
- La specificità anatomica è importante per lo studio delle risposte cellulari nel cervello.
- Questo metodo può essere applicato a diverse problematiche biologiche in vari tessuti.
Scopo dello studio
- Per raccogliere tipi cellulari specifici dall'amigdala con precisione.
- Per misurare l'espressione genica in singole cellule.
- Per esplorare le risposte cellulari a malattie o alterazioni.
Metodi Utilizzati
- Micotomia con laser per la raccolta delle cellule.
- RT-qPCR in microfluidica per l'analisi del trascrittoma.
- Elaborazione di campioni ad alto rendimento.
- Applicazione del metodo a diversi contesti biologici.
Risultati Principali
- Corretta raccolta di singoli neuroni, microglia e astrociti.
- Identificazione di sottotipi cellulari con specificità anatomica.
- Applicabilità dimostrata del metodo su diversi tessuti.
- Approfondimenti sulle risposte cellulari individuali a perturbazioni.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce uno strumento potente per la ricerca in neuroscienze.
- Migliora la nostra comprensione dell'espressione genica in tipi cellulari specifici.
- L'approccio può essere adattato a diverse domande di ricerca in biologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Questo metodo consente un profilo trascrizionale ad alta risoluzione di singole cellule anatomicamente definite, supportando la validazione degli obiettivi attraverso la riduzione del rischio fenotipico nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze. Associando l'eterogeneità cellulare a risposte funzionali in regioni cerebrali rilevanti per la malattia, migliora la fiducia predittiva nella selezione precoce degli obiettivi. La piattaforma qPCR microfluidica scalabile permette letture quantitative e riproducibili che guidano le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di farmaci per la dipendenza da oppioidi e altre indicazioni del sistema nervoso centrale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'eterogeneità trascrizionale in cellule anatomicamente adiacenti per chiarire i fenotipi funzionali e ridurre l'ambiguità meccanicistica nelle ipotesi sui bersagli.
- Valore operativo: Permette l'isolamento di neuroni, microglia e astrociti dal nucleo centrale dell'amigdala con specificità anatomica per la chiarificazione dei percorsi.
- Valore strategico: Facilita l'identificazione di sottotipi cellulari che guidano la priorizzazione dei bersagli e la selezione del portafoglio nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi di espressione genica da singole cellule, consentendo screening di composti affidabili in sistemi cellulari validati.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro standardizzato ad alto rendimento (96 campioni per batch) per un profilo trascrizionale riproducibile in diverse condizioni sperimentali.
- Valore strategico: Produce letture scalabili e multiplex che supportano la riproducibilità dei saggi e il confronto incrociato dei dati in percorsi di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega le risposte trascrizionali specifiche per tipo cellulare (ad esempio, l'attivazione degli astrociti nel distacco) ai meccanismi della malattia, sostenendo una validazione preclinica allineata ai biomarcatori.
- Valore operativo: Permette la continuità dalla fase di scoperta al lavoro preclinico fornendo dati singola-cellula risolti anatomicamente e validati a livello molecolare.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento con rischio calibrato rivelando quali tipi cellulari sono maggiormente coinvolti negli stati patologici, come gli astrociti nel distacco da oppioidi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso della scoperta consentendo un'analisi ipotetica a singola cellula, dall'isolamento del tessuto alla lettura trascrizionale, sostenendo gli sforzi di validazione precoce delle target e di identificazione dei composti promettenti nelle neuroscienze.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi isolando singole cellule da regioni anatomiche definite e misurandone i profili di espressione genica.
- Screening: Fornisce output trascrizionali quantitativi pronti per il saggio con elevata riproducibilità, consentendo una valutazione affidabile delle risposte cellulari a perturbazioni.
- Analisi: Genera dati di espressione genica multiplex (40 geni) adatti ad analisi multivariata e screening comparativo tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti a livello di singola cellula ai meccanismi della malattia a livello tissutale, come l'infiammazione mediata dagli astrociti nell'amigdala durante l'astinenza.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma riutilizzabile per il profilo trascrizionale in diversi tessuti e modelli di malattia, non limitata alla dipendenza da oppioidi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo il rumore biologico grazie alla specificità anatomiche e cellulari nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante RT-qPCR microfluidica con elevata capacità di elaborazione dei campioni (96-plex) e minima variabilità tecnica.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli obiettivi grazie a informazioni meccanicistiche ottenute da popolazioni cellulari rare.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio identificando quali tipi cellulari determinano risposte trascrizionali rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella microdissezione con laser, nell'incisione di tessuti e nella mappatura anatomica del cervello mediante atlante cerebrale del ratto e riferimento al bregma.
- È dipendente da infrastrutture per RT-qPCR microfluidica, comprese chip per array dinamici, controller IFC HX e strumentazione termociclica per la pre-amplificazione e la qPCR.
- Necessita di protocolli standardizzati per la manipolazione dei campioni, la lisi e il controllo delle contaminazioni, al fine di mantenere l'integrità delle singole cellule e l'accuratezza dei dati.
- Comprende fasi di ottimizzazione come la minimizzazione delle bolle d'aria durante il caricamento del chip e la validazione tramite marcatori molecolari (ad esempio, NeuN, Maf, Gfap) per confermare la specificità del tipo cellulare.
- È limitato dalla qualità e dal rendimento dell'RNA ottenuti da cellule isolate mediante microdissezione con laser, richiedendo un'attenta lavorazione dei campioni per evitare il degrado durante l'estrazione e la conservazione.
