Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane
31 marzo 2021
Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.
Questo protocollo descrive un metodo per generare una popolazione ben caratterizzata di cellule endoteliali emogeniche umane. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare la regolazione molecolare e la transizione endoteliale-ematopoietica. Inizia coltivando cellule staminali embrionali umane per quattro giorni per differenziarle in cellule endoteliali primordiali.
Il quinto giorno, aspirare il mezzo sopra le cellule. Quindi lavare delicatamente le cellule con un millilitro di DMEM / F-12 per pozzetto. Aggiungere un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali ematogeniche appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Il sesto e il settimo giorno, sostituire il mezzo sopra le cellule con un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali omogenee appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per altre 24 ore. L'ottavo giorno. Dopo aver staccato e lavato le celle, dividerle uniformemente in provette da microcentrifuga su ghiaccio, ciascuna contenente un minimo di 600 microlitri di cellule ad una densità di 1 volte 10 alle 5 celle per millilitro.
Aggiungere anticorpi alle provette contenenti le cellule come appropriato e incubare su ghiaccio protetto dalla luce per 30 minuti. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 1000 volte G e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 600 microlitri di tampone di selezione ghiacciato.
Filtrare i campioni attraverso il tappo filtrante a rete di tubi FACS da cinque millilitri e conservare le celle su ghiaccio al riparo dalla luce per la selezione immediata delle cellule. Per isolare le cellule endoteliali emogeniche mediante FACS, prima eliminare la popolazione cellulare CD45-negativa. Quindi, all'interno della popolazione CD45-negativa, le cellule CD31-positive.
Successivamente all'interno della popolazione CD31-positiva, porta per la popolazione cellulare VE-caderina-negativa. E poi all'interno della popolazione VE-caderina-negativa, porta per le cellule c-Kit-positive. Dalla popolazione c-Kit-positiva, porta la popolazione cellulare CD34-positiva.
E infine dalla popolazione cellulare CD34-positiva, identificare e raccogliere le cellule KDR-positive. Dopo aver seminato cellule endoteliali emogeniche in un mezzo a base di metilcellulosa formulato per la crescita di cellule progenitrici ematopoietiche, le colonie di unità eritroidi formanti colonie e unità eritroidi formanti esplosione vengono contate l'ottavo giorno. Unità formante colonie-granulociti-macrofagi e unità formanti colonie-granulociti, eritroidi, macrofagi e megacariociti.
Le colonie progenitrici ematopoietiche multipotenti vengono contate il giorno 14. Per 1000 cellule endoteliali emogeniche placcate, vengono generate circa 20 unità formanti colonie. Nelle colture sono visibili anche cellule con morfologia cellulare endoteliale.
Queste sono le cellule endoteliali emogeniche che danno origine a progenitori ematopoietici multilineare a livello unicellulare. Questo protocollo è un sistema di coltura 2D privo di siero e alimentatore murino in grado di generare cellule endoteliali emogeniche umane in circa una settimana.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per ottenere cellule endoteliali ematopoietiche da cellule staminali embrionali umane in circa una settimana. Il metodo consente ai ricercatori di generare una popolazione ben caratterizzata di queste cellule, fondamentali per lo studio della transizione da endoteliale a ematopoietica e con possibili applicazioni nella medicina rigenerativa e nella produzione di emoderivati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Biologia vascolare
- Ematopoiesi
- Ingegneria tissutale
Sfondo
- I vasi sanguigni sono essenziali per la funzione dei tessuti e sono rivestiti da cellule endoteliali vascolari.
- Le cellule endoteliali ematogène sono un sottotipo specializzato che dà origine a cellule staminali ematopoietiche e cellule progenitrici durante lo sviluppo.
- La generazione di queste cellule in vitro è utile per lo studio dello sviluppo delle cellule del sangue e per possibili applicazioni terapeutiche.
- I protocolli esistenti per la derivazione di cellule endoteliali non producono cellule endoteliali ematogène ben caratterizzate a partire da cellule staminali umane.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo riproducibile per la generazione di cellule endoteliali ematopoietiche da cellule staminali embrionali umane.
- Permettere lo studio della regolazione molecolare e della transizione da endoteliale a ematopoietica in vitro.
- Fornire un sistema senza cellule di supporto e senza siero, adatto per applicazioni successive.
Metodi Utilizzati
- Coltura di cellule staminali embrionali umane e differenziazione progressiva nell'arco di otto giorni.
- Induzione delle linee mesodermiche ed endoteliali mediante l'uso di specifici fattori di crescita e molecole di piccole dimensioni (ad esempio, inibitore della GSK3β, bFGF, BMP4, VEGF-A, acido retinoico).
- Citometria a flusso (FACS) per il gating sequenziale e l'isolamento di cellule endoteliali ematopoietiche in base ai marcatori di superficie (CD45-, CD31+, VE-cadherina-, c-Kit+, CD34+, KDR+).
- Valutazione funzionale mediante saggi di formazione di colonie in mezzo a base di metilcellulosa per analizzare il potenziale ematopoietico.
Risultati principali
- Il protocollo produce una popolazione definita di cellule endoteliali ematopoietiche entro una settimana.
- Si generano circa 20 unità formanti colonie ogni 1000 cellule endoteliali ematopoietiche, indicando un potenziale ematopoietico robusto.
- Sono osservate colonie di progenitori ematopoietici eritroidi e multipotenti.
- La morfologia delle cellule endoteliali è mantenuta in coltura, confermando l'identità cellulare.
Conclusioni
- Questo protocollo privo di cellule di supporto e di siero genera in modo efficiente cellule endoteliali ematopoietiche umane da cellule staminali embrionali.
- Il metodo facilita lo studio in vitro della transizione da endoteliale a ematopoietica e della regolazione molecolare.
- Fornisce una piattaforma per la potenziale generazione ex vivo di prodotti ematici e riduce la dipendenza dai donatori umani.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La differenziazione diretta di cellule endoteliali ematopoietiche da cellule staminali pluripotenti umane affronta un collo di bottiglia critico nella modellizzazione dello sviluppo ematopoietico e nella generazione di linee ematiche ex vivo. Questa capacità consente una riduzione meccanicistica dei rischi associati alla transizione da endoteliale a ematopoietica e supporta una maggiore affidabilità predittiva nei processi terapeutici cellulari e nella medicina rigenerativa nelle fasi iniziali. La progettazione del protocollo, priva di cellule feeder e di siero, migliora la riproducibilità e la scalabilità per i portafogli aziendali di ricerca e sviluppo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei percorsi molecolari che regolano la transizione da endoteliale a ematopoietica.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli coinvolti nella specificazione della linea ematica.
- Facilita la riduzione predittiva dei rischi associati a bersagli candidati nello sviluppo ematopoietico.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una popolazione cellulare standardizzata e ben caratterizzata per saggi funzionali successivi.
- Consente la valutazione quantitativa della formazione di colonie ematopoietiche a partire da progenitori definiti.
- Permette lo screening riproducibile di modulatori che influenzano il destino endoteliale o ematopoietico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Stabilisce una piattaforma per la modellizzazione in vitro di difetti ematopoietici rilevanti per le malattie.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di strategie di generazione delle cellule del sangue.
- Supporta l' avanzamento mirato alla riduzione del rischio di concetti terapeutici basati su cellule.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la generazione e l'isolamento robusti di cellule endoteliali ematopoietiche per studi meccanicistici e saggi funzionali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla regolazione molecolare dell'emergenza delle linee ematiche.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili di formazione di colonie per analisi comparative.
- Analisi: Offre l'analisi mediante citofluorimetria e la quantificazione delle colonie per letture oggettive.
- Ricerca traslazionale: Collega la modellizzazione in vitro alla valutazione preclinica del potenziale ematopoietico.
- Riutilizzo aziendale: Offre un sistema scalabile e privo di cellule supporto, adattabile a diverse linee di cellule staminali e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella modellizzazione della linea ematopoietica e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro di differenziazione cellulare.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione per i programmi di terapia cellulare e medicina rigenerativa.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione basata sul rischio dei candidati terapeutici cellulari nelle fasi iniziali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura e nei protocolli di differenziamento delle cellule staminali pluripotenti umane.
- Richiede l'accesso a strumentazione per citometria a flusso per l'ordinamento cellulare multiparametrico.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le strategie di gating e la quantificazione delle colonie.
- Adattabile a diverse linee cellulari staminali umane con ottimizzazione del protocollo.
- Dipendente da pannelli di anticorpi validati e da saggi funzionali basati su metilcellulosa.
