Profilazione di composti volatili nel frutto del ribes nero utilizzando la microestrazione in fase solida dello spazio di testa accoppiata alla gascromatografia-spettrometria di massa
9 giugno 2021
Una piattaforma di microestrazione-gascromatografia in fase solida dello spazio di testa è descritta qui per l'identificazione e la quantificazione volatili veloci, affidabili e semi-automatizzate nei frutti di ribes nero maturi. Questa tecnica può essere utilizzata per aumentare la conoscenza dell'aroma della frutta e per selezionare cultivar con sapore migliorato ai fini dell'allevamento.
Migliorare l'aroma della frutta è uno degli obiettivi principali nei programmi di allevamento. Per questo, abbiamo bisogno di una tecnica affidabile che ci permetta di misurare i componenti volatili nei frutti. Questa tecnica è veloce e semi-automatizzata, consentendo di misurare fino a 22 campioni al giorno.
Inoltre, è relativamente economico e richiede un'elaborazione minima del campione. Questo metodo può essere facilmente applicato a tutte le specie di frutta, come le colture di bacche economicamente importanti. Inoltre, la dimensione della libreria del composto rilevato può essere facilmente aumentata.
Per iniziare, aggiungere un millilitro di soluzione di cloruro di sodio a un tubo da cinque millilitri contenente il campione congelato di wade. Agitare la provetta fino a quando il campione non è completamente scongelato e omogeneizzato. Quindi centrifugare a 5.000 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Tagliare l'estremità della punta della pipetta da 1.000 microlitri e utilizzarla per trasferirla al surnatante al cloruro di sodio contenente la lima dello spazio di testa. Aggiungere cinque microlitri di standard interno a ciascun campione contenente il file dello spazio di testa. Posizionare il file dello spazio di testa chiuso in un campionatore automatico GC-MS, a temperatura ambiente, per un'esecuzione automatica HS-SPME/GC-MS, assicurandosi che le repliche biologiche non vengano posizionate in posizioni successive nel campionatore automatico.
Pre-incubare i file dello spazio di testa per 10 minuti a 52 gradi Celsius con agitazione a 17 volte G.Inserire un dispositivo SPME nella fiala per esporre la fibra allo spazio di testa ed eseguire l'estrazione di VOC per 30 minuti a 50 gradi Celsius con agitazione a 17 volte G.Introdurre la fibra nella porta di iniezione per un minuto a 250 gradi Celsius in modalità splitless per il desorbimento volatile. Quindi pulire la fibra in una stazione di pulizia SPME con azoto per cinque minuti a 250 gradi Celsius. Analizzare i COV con un gascromatografo accoppiato a uno spettrometro di massa a trappola ionica come descritto nel manoscritto rileva.
Aprire i file di profilo GC-MS non elaborati. Per identificare i composti, confrontare i tempi di ritenzione, gli spettri di massa e gli indici di ritenzione lineare di Kovats con gli indici di ritenzione ottenuti da standard autentici. Per ogni standard commerciale, annotare il tempo di ritenzione nella massa più abbondante per caricare gli ioni.
Quindi selezionare uno specifico ione M per Z per ogni VOC. Calcolare l'area di picco di ciascun VOC rispetto a quella dello standard interno per ridurre al minimo la variazione strumentale e la deriva di intensità. Per la correzione dell'effetto batch, normalizzare l'area di picco VOC di ciascun campione nell'area di picco corrispondente nel campione di controllo analizzato nella stessa esecuzione.
Un profilo di cromatogramma ionico totale volatile del frutto del ribes nero maturo ottenuto da HS-SPME / GC-MS ha identificato 63 COV appartenenti a esteri, aldeidi, alcoli, chetoni, terpeni e furani sulla base di una libreria sviluppata per profilare le specie di frutti di bosco. Alcuni dei picchi più abbondanti osservati corrispondono a due monoterpeni, linalolo e terpineolo, e due composti C6, 2-Hexenal e 3-Hexenal. Gli spettri di massa ottenuti da profili di corrente nera nel loro confronto con spettri di standard commerciali puri sono mostrati per 2-Hexenal e terpineolo.
PCA dei profili VOC di quattro diverse cultivar di corrente nera, ha dimostrato che l'ambiente influisce fortemente sul contenuto volatile, poiché PC1 separa i campioni in base alla loro posizione. Il genotipo efficace può essere osservato con PC2, poiché Ben Tirran è chiaramente separato dalle restanti cultivar. Il contenuto relativo di linalolo e 2-hexenal nelle quattro cultivar nere attuali valutate conferma che il contenuto di linalolo era generalmente più alto in Polonia che in Scozia, mentre il 2-hexenal ha mostrato la tendenza opposta.
La percentuale di linalolo era più alta nelle cultivar di Ben Tirran, in quella di 2-Hexenal era più alta nelle cultivar di Ben Tron. È importante iniziare con materiale congelato, macinato in polvere fine per garantire una corretta estrazione volatile. Una volta estratto, il campione deve essere inserito nel campionatore automatico, il prima possibile.
Questo metodo può essere combinato con altre piattaforme metaboliche per identificare altri importanti metabolici, per gusto alimentare o valore nutrizionale, per allevare varietà con caratteristiche organolettiche migliorate.
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Panoramica
Questo articolo presenta una piattaforma di microestrazione in fase solida in testa al vaso accoppiata a cromatografia gassosa per l'identificazione e la quantificazione rapida e affidabile di composti volatili in frutti maturi di ribes nero. Questa tecnica semi-automatica migliora la comprensione dell'aroma del frutto e agevola la selezione di cultivar con sapore migliorato ai fini della riproduzione.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Miglioramento genetico della frutta
- Analisi dei composti volatili
- Caratterizzazione dell'aroma
Sfondo
- Migliorare l'aroma dei frutti è un obiettivo fondamentale nei programmi di miglioramento genetico.
- Sono necessarie tecniche affidabili per misurare i composti volatili nei frutti.
- Questo metodo è applicabile a diverse specie di frutti, inclusi coltivi di bacche di importanza economica.
- La libreria dei composti rilevati può essere ampliata facilmente.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido e semi-automatico per l'analisi dei composti volatili.
- Approfondire la conoscenza sull'aroma dei frutti.
- Supportare la selezione di cultivar con un sapore migliore per l'ibridazione.
Metodi Utilizzati
- Microestrazione in fase solida sullo spazio di testa
- Cromatografia gassosa
- Elaborazione del campione con requisiti minimi
- Misurazione di fino a 22 campioni al giorno
Risultati principali
- Dimostrato l'efficacia della tecnica nell'identificazione dei composti volatili.
- Fornito informazioni sui profili aromatici dei frutti maturi di ribes nero.
- Evidenziato il potenziale di applicazione su diverse specie di frutta.
- Evidenziato la convenienza economica e l'efficienza del metodo.
Conclusioni
- La piattaforma sviluppata è uno strumento prezioso per la ricerca sull'aroma dei frutti.
- Può facilitare la selezione di cultivar superiori nei programmi di miglioramento genetico.
- La versatilità del metodo lo rende applicabile a un'ampia gamma di frutti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione affidabile di composti organici volatili (VOC) supporta i programmi di miglioramento genetico della frutta consentendo una valutazione oggettiva dei profili aromatici associati all'accettazione da parte del consumatore. Questo metodo HS-SPME/GC-MS fornisce una piattaforma semi-automatica ad alta produttività per l'identificazione di biomarcatori chiave dell'aroma, come terpenoidi e composti volatili C6, nel ribes nero e in altre specie di bacche. L'approccio facilita la selezione di cultivar basata sui dati e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta, collegando i profili chimici a caratteristiche organolettiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi degli effetti genetici e ambientali sui percorsi biosintetici dei composti organici volatili.
- Valore operativo: Permette la verifica di ipotesi relative a caratteristiche aromatiche mediante dati quantitativi di biomarcatori.
- Valore predittivo: Collega specifici composti organici volatili come il linalolo e il 2-esenale agli effetti del genotipo e della località, supportando decisioni mirate in ambito di miglioramento genetico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera profili riproducibili di composti organici volatili mediante normalizzazione con standard interno e controlli di correzione per lotto.
- Scalabilità: Consente di processare fino a 22 campioni al giorno con intervento manuale minimo, permettendo lo screening di germoplasmi diversi.
- Riutilizzo della piattaforma: Una libreria di composti espandibile consente l’applicazione su diverse specie di frutta e su diversi percorsi metabolici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: I biomarcatori VOC collegano la scoperta e la validazione preclinica correlando la composizione chimica con gli esiti sensoriali.
- De-risking Meccanicistico: Riduce l'ambiguità nel collegare genotipo a fenotipo attraverso letture chimiche validate.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Consente la priorizzazione di cultivar con profili aromatici superiori basandosi su dati quantitativi riproducibili.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla generazione di ipotesi all'identificazione di candidati promettenti, fornendo dati quantitativi sui composti organici volatili che orientano le decisioni di miglioramento genetico e supportano la continuità traslazionale nei programmi di miglioramento delle colture.
- Biologia della scoperta: Chiarisce i percorsi biosintetici e le interazioni gene-ambiente che influenzano la produzione di composti volatili.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi per la valutazione ad alto rendimento della diversità genetica.
- Analisi: Utilizza la normalizzazione dell'area dei picchi e la conferma del tempo di ritenzione per un'accurata identificazione dei composti e la correzione delle deriva.
- Ricerca traslazionale: Collega i profili dei composti organici volatili alla qualità organolettica, favorendo lo sviluppo di cultivar con aroma migliorato.
- Riutilizzo aziendale: Il flusso di lavoro semi-automatico e la libreria espandibile supportano un uso a lungo termine in diversi programmi di miglioramento genetico e specie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo collegando i biomarcatori VOC ai fattori genetici e ambientali.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso standardizzazione interna, correzione dei lotti e riduzione della deriva.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nella selezione dei cultivar riducendo la dipendenza da valutazioni sensoriali soggettive.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei ceppi di miglioramento adattata al rischio, basata su metriche oggettive della qualità dell'aroma.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'estrazione di VOC, nell'uso del GC-MS e nelle tecniche di normalizzazione dei dati.
- Necessita di un GC-MS dotato di capacità SPME, standard interni e unità di agitazione a temperatura controllata.
- Richiede coerenza tra i diversi gruppi di lavoro nella manipolazione dei campioni, in particolare nella lavorazione di tessuti congelati e nella preparazione delle provette.
- Deve tenere conto degli effetti di matrice tra diverse specie di frutta durante l'ampliamento della libreria di composti.
- È limitato dalla volatilità dei composti e dall'affinità della fibra, che possono influenzare il rilevamento di alcune classi di VOC.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Sample Preparation
1:17
Headspace Solid-phase Microextraction (HS-SPME) Coupled with Gas Chromatography-mass Spectrometry (GC-MS) Data Acquisition
2:23
Analysis of GC-MS Profile Chromatograms: VOC Identification and Semi-quantification
3:20
Results: Analysis of HS-SPME/GC-MS Chromatograms, PCA, and Relative VOC Content in Blackcurrant Fruits
4:48
Conclusion
