Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

Il protocollo tiene traccia simultaneamente delle risposte dello sciame batterico a diverse concentrazioni di induttori su un agar semisolido. Ciò si ottiene in modo economicamente vantaggioso. Questa tecnica di screening ad alto rendimento annulla la necessità di agar con varie concentrazioni di induttori per osservare le risposte microchemiotattiche.

La tecnica è progettata per lo screening farmacologico e anche per osservare le risposte SD micropatogene. Inoltre, può essere utilizzato per studiare microrisposte a vari segnali biochimici nell'ospite umano. Questo metodo può fornire informazioni sulla chemiotassi batterica.

I batteri risponderanno a varie concentrazioni di attrattivi chimici noti come chemiotassi positiva o repellenti chimici noti come chemiotassi negativa. Un set up accuratamente preparato è essenziale per evitare variazioni tra l'angolo del gel dello strato inferiore per evitare il problema della riproducibilità. Per iniziare, etichettare 13 per 13 centimetri quadrati piastre di Petri con macchie e nomi di induttori.

Quindi appoggiare i piatti oltre il bordo dei coperchi. Aggiungere la soluzione di arabinosio al mezzo caldo dello strato inferiore. Aggiungere 40 millilitri di medio strato inferiore caldo.

Lasciare indisturbato il mezzo dello strato inferiore scoperto per un'ora all'interno di una cappa a flusso laminare. Una volta che lo strato inferiore è completamente solidificato, rimuovere i coperchi e posare le piastre di Petri all'interno di una cappa a flusso laminare. Aggiungere 40 millilitri di terreno caldo dello strato superiore utilizzando un filtro a pipetta motorizzato.

Curare le piastre a doppio strato coperte e indisturbate per un'ora, quindi conservarle a quattro gradi Celsius per 24 ore. Posizionare la carta A4 contrassegnata sotto una piastra sfumata ben solidificata. Spingere il lato più ampio di una punta della pipetta da 100 microlitri nella superficie media semisolida nella posizione contrassegnata e premere la punta della pipetta fino a raggiungere il fondo del mezzo dello strato superiore.

Quando la punta tocca il fondo, smettere di applicare qualsiasi forza verticale alla punta e ruotare delicatamente la punta per isolare il contenuto del pozzetto cilindrico. Spostare orizzontalmente la punta della pipetta lungo una piccola distanza per consentire il flusso d'aria nel luogo stretto messo da parte. Premere la punta con l'indice per bloccare il flusso di gas all'interno della punta.

Estrarre la punta verticalmente, mantenendo il contenuto del pozzo nella punta mentre la si estrae. Aggiungi 80 microlitri della cultura della crescita notturna in ogni pozzo. Estrarre le piastre dello sciame dall'incubatrice una alla volta ogni 12 ore e inserirle nel sistema di imaging del gel.

Selezionare la modalità di imaging su gel, esporre la piastra dello sciame alla luce bianca e regolare la lunghezza focale per ottenere una visione chiara degli sciami. Migliora la luminosità degli sciami per un'osservazione precisa regolando il tempo di esposizione a 300 millisecondi. Regolare la soglia per ridurre al minimo le interferenze provenienti dalla luce di sfondo.

Salvare il file immagine per ulteriori analisi. Registrare il tempo di imaging, il tipo di induttore, l'orientamento del gradiente e i ceppi in un file txt. Fare clic su Elabora, quindi su Ombre per migliorare la nitidezza dell'immagine.

Fare clic su Processo seguito da Batch per elaborare l'immagine. Quindi elaborare un'immagine come riferimento facendo clic su Elabora, Ombre e Sud. Fare clic su Elabora, Batch, Macro per aprire la finestra Processo batch.

Cerca i comandi visualizzati nella finestra. Digitare l'indirizzo della cartella delle immagini originali nell'indirizzo del file di output facendo clic su Elabora nella finestra Processo batch. Utilizzate lo strumento di traccia della bacchetta per selezionare gli sciami singolarmente e fate doppio clic sullo strumento di traccia della bacchetta per regolare la tolleranza fino a quando la linea generata non si adatta correttamente al limite dello sciame.

Fare clic su Analizza, quindi su Misura per esportare il valore dell'area. E.coli K12 YdeH è stato testato su piastre a gradiente di arabinosio utilizzate per dimostrare il processo di sciame superficiale con sovrapposizione che si verifica tra pozzi adiacenti. Una piastra con tre pozzetti di prova ha permesso la formazione di confini non sovrapposti.

La motilità dello sciame di P.aeruginosa PAO1 YdeH è stata promossa con un aumento della concentrazione di arabinosio dalla concentrazione più bassa, ma gradualmente limitato con concentrazioni più elevate di arabinosio. I ceppi di tipo selvaggio di E.coli K12 testati su piastre a gradiente di resveratrolo entro l'intervallo di concentrazione da zero a 400 microliti hanno mostrato una modesta restrizione della motilità dello sciame con l'aumento della concentrazione di resveratrolo. Le aree dello sciame sono state quantificate dal software ImageJ.

La curva dello sciame mostrava le risposte di concentrazione multiple. La parte più cruciale di questa procedura è la produzione di una piastra a sciame a doppio strato con un intervallo di concentrazione specifico di induttori. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare lo sciame superficiale indotto all'interno di uno specifico intervallo di concentrazione e di quantificare gli effetti di altri induttori e componenti sullo sciame.