Intervista: Antigen Presentazione glicolipide da CD1d e il potenziale terapeutico di attivazione delle cellule NKT

Ciao, mi chiamo Mitchell Cronenberg e lavoro presso il La Jolla Institute for Allergy and Immunology. Sono effettivamente il presidente e direttore scientifico, ma dirigo anche un laboratorio di ricerca molto attivo e proprio di questo parleremo, naturalmente, in particolare di una delle tecnologie che utilizziamo, ovvero i tetrameri CD1D. Gran parte del lavoro nel mio laboratorio riguarda le cellule T reattive a CD1D.

E queste cellule sono uniche perché riconoscono glicolipidi piuttosto che peptidi. Un altro settore del mio laboratorio si occupa di un argomento completamente diverso, il sistema immunitario mucosale e la sua regolazione. Le molecole CD1 sono molecole presentanti l'antigene, il che significa che legano antigeni o frammenti di proteine o altre molecole e li espongono al riconoscimento da parte delle cellule T.

Ora esistono realmente due tipi diversi di molecole presentanti l'antigene. Alcune di queste trattengono o presentano peptidi, mentre altre trattengono lipidi e glicolipidi. Le molecole CD1 trattengono lipidi e glicolipidi.

Questa è la loro funzione: esse tengono fermi o presentano questi lipidi e glicolipidi ai linfociti T. In realtà esistono quattro tipi diversi di molecole CD1, CD1A, CD1B, CD1C e CD1D. In particolare, ci concentriamo su CD1D, che è probabilmente il tipo meglio studiato, anche perché esistono modelli murini. CD1D presenta glicolipidi a un particolare tipo di linfocita T chiamato linfocita T natural killer, un insolito globulo bianco che possiede caratteristiche della risposta immunitaria innata e adattativa.

I glicolipidi che vengono presentati possono essere glicolipidi self, anche se al momento questi non sono molto ben caratterizzati, oppure possono essere glicolipidi microbici. E i glicolipidi che sappiamo essere presentati provengono da due fonti. Una è costituita da quelle che vengono chiamate batteri FMS, che probabilmente sono i batteri più abbondanti nella biosfera.

Vivono nell'oceano, vivono nelle piante, vivono nel suolo. Tuttavia, non causano malattie a molte persone. Siamo molto abituati a convivere con questi batteri, suppongo.

E la seconda categoria che conosciamo, un diverso tipo di glicolipide chiamato glicolipide contenente digliceride. Questi sono presenti in Borrelia burgdorferi, che causa la malattia di Lyme, e probabilmente in molti altri patogeni. E stiamo solo iniziando a scoprire quali sono i diversi tipi di batteri che possiedono questi glicolipidi.

Pertanto, abbiamo ciò che vengono chiamati glicolipidi segnale da SMS e glicerolipidi dialchilici dal Borrelia e probabilmente molti altri che sono veramente patogeni. Questi lipidi vengono caricati principalmente su molecole CD1D delle cellule dendritiche, anche se potrebbero essere presenti anche nei linfociti B, nelle cellule ER del fegato e forse in altri tipi cellulari. Queste molecole CD1D attraversano lisosomi ed endosomi, dove probabilmente si legano a questi lipidi, per poi trasportarli sulla superficie cellulare, dove possono essere riconosciuti da cellule T, inclusi i linfociti T natural killer di cui ho parlato in precedenza.

Una delle cose che accade se si è esposti a un batterio che possiede glicolipidi è che le cellule T NK vengono attivate molto rapidamente. Le cellule T convenzionali, in altre parole le cellule T reattive ai peptidi, richiedono tipicamente tre o quattro giorni per avviare una risposta immunitaria efficace, specialmente se non hanno già incontrato l'antigene.

In altre parole, se sono, sono naive. Al contrario, le cellule T NK possono essere attivate nell'arco di poche ore e inizieranno a produrre citochine come l'interferone gamma, importante per l'eliminazione dei batteri in un periodo di tempo molto, molto breve. E in questo modo, esse presentano aspetti simili alla risposta immunitaria innata del modello.

Studiando antigeni modello, sappiamo che CD1D entra negli endosomi tardivi e nei lisosomi, compartimenti intracellulari molto acidi in cui gli antigeni glicolipidici vengono caricati su CD1 e, in effetti, esistono particolari proteine di trasporto all'interno delle cellule presentanti l'antigene, come le cellule dendritiche, che facilitano il caricamento dei lipidi sulla molecola CD1D. Con questi batteri fona, batteri borre e altri con cui abbiamo a che fare, si tratta di batteri extracellulari. Pertanto, gli antigeni lipidici devono essere trasportati in qualche modo all'interno della cellula, probabilmente nei lisosomi, dove vengono caricati sulla molecola CD1.

E poi c'è un'attivazione immediata della cellula NKT e tutto ciò deve avvenire entro poche ore nei sinusoidi, nel fegato, nella milza, forse nel midollo osseo e in altri siti in cui si trovano le cellule NKT. La struttura tetramerica è fondamentale per definire in modo inequivocabile queste cellule T natural killer, che possiedono proprietà innate che le distinguono da altre cellule T. Gli altri marcatori disponibili sono troppo ambigui, mentre i tetrameri permettono di identificare le cellule in base alla specificità del loro recettore per l'antigene, un aspetto chiave che le definisce. La preparazione dei tetrameri ha origini molto antiche.

È stato inventato da Mark Davis e John Alman, e l'idea era che il recettore delle cellule T ha un'affinità bassa, e se si desidera definire o identificare le cellule in base alla loro specificità, i peptidi che riconoscono o i complessi di peptidi e molecole presentanti l'antigene non hanno affinità sufficiente, forza di legame adeguata per permettere l'identificazione della cellula. Quindi, ciò che Mark Davis e John Allman hanno inventato è stata questa tecnologia dei tetrameri, un metodo per produrre tetrameri in alcuni casi OCR della molecola presentante l'antigene più la molecola che presenta, che fondamentalmente aumenta l'affinità o la forza dell'interazione. In questo modo è possibile visualizzare la cellula specifica per un peptide influenzale e una particolare molecola presentante l'antigene o qualunque altro antigene che vi interessa.

Tecnologia molto importante perché ti permette, ad esempio, di valutare quanto efficace potrebbe essere un regime vaccinale. Quello che abbiamo fatto a partire dalla fine degli anni '90, inizialmente con un articolo pubblicato nel 2000 che è stato citato circa 500 volte ad oggi, è stato semplicemente adattare tale tecnologia ai lipidi.

Abbiamo quindi prodotto molecole solubili di CD1 e, mediante metodi che descriverò brevemente, siamo stati in grado di tetramerizzarle, ossia di aggregarle con specifici glicolipidi, e in questo modo utilizzarle come reagenti per saggiare recettori specifici delle cellule T. In altre parole, quei recettori che riconoscono il glicolipide di nostro interesse in associazione con CD1D. I tetrameri possono essere utilizzati in ogni situazione in cui si desideri analizzare il numero di cellule NKT, il loro stato di attivazione e la loro funzione.

E nel nostro laboratorio potrebbe provenire da uno qualsiasi di diversi progetti. Ad esempio, se si desidera sapere se un particolare mutante e un percorso di segnalazione influenzano lo sviluppo delle cellule T NK, possiamo farlo utilizzando i nostri tetrameri, analizzando il numero di cellule T NKT. Inoltre, esistono altri marcatori, altre proteine di superficie cellulare che possiamo esaminare per valutare se le cellule T NKT sono mature o attivate; utilizzando i tetrameri, dopo una stimolazione antigenica, possiamo inoltre verificare non solo se sono attivate, ma anche quali citochine producono.

Pertanto, possiamo combinare la colorazione con tetramero, ad esempio, con la colorazione intracellulare per citochine e chiederci quale percentuale delle cellule NKT produce interferone gamma, quale percentuale produce IL-4, quale percentuale produce entrambe, utilizzando la citometria a flusso multiparametrica; in questo modo, possiamo porre diverse domande sulla produzione di citochine direttamente ex vivo da parte di queste cellule. Possiamo inoltre effettuare ulteriori esperimenti. Ad esempio, possiamo utilizzare i tetrameri per purificare le cellule T NK da coltivare in vitro, al fine di studiare come interagiscono con altri tipi cellulari, oppure persino trasferirle in un animale ricevente, che potrebbe mancare di cellule T NK per motivi genetici.

Vogliamo ripristinare quella funzione. Possiamo farlo e indagare su dove le cellule si localizzano e su come svolgono la loro funzione. Infine, so che, nel caso delle cellule NKT umane, alcune persone hanno effettivamente utilizzato i tetrameri per espandere linee cellulari in vitro, al fine di coltivare cellule per scopi analitici e potenzialmente anche terapeutici.

Bene, utilizziamo un sistema di espressione virale Bao per generare tetrameri CD1D. Il processo inizia con un comune costrutto di DNA contenente il promotore e l'espressione della microglobulina BID e della catena pesante CD1D. Dunque, questa molecola CD1 è un'eterodimero costituito da due polipeptidi.

Abbiamo quindi questo sistema di espressione con due promotori, e infettiamo le cellule di coltura tessutale di insetto con i virus vaccinia, titolati con attenzione come spiegato dal nostro canale. Successivamente infettiamo le cellule e raccogliamo dal mezzo di coltura tessutale la proteina espressa dalle cellule. La catena pesante CD1D è stata ingegnerizzata appositamente per la produzione di tetrameri.

Ci sono due cose, o meglio dovrei dire tre cose, che facciamo. La prima è che rimuoviamo il frammento transmembrana. Quindi, stiamo esprimendo una proteina solubile.

In secondo luogo, abbiamo aggiunto un marcatore esa, his, in modo che la proteina possa essere purificata mediante cromatografia a ioni metallici. E in terzo luogo, abbiamo un sito detto beer, per la biotinilazione enzimatica. E questa è l'innovazione.

Era molto importante quando Davis e Alman hanno inventato per la prima volta la tecnologia di produzione dei tetrameri. Quindi, dopo aver raccolto la proteina, questa viene purificata mediante cromatografia su colonna al nichel. A volte, successivamente, eseguiamo una cromatografia a esclusione molecolare.

Quindi la proteina può essere biotinilata enzimaticamente e incubata, e una volta biotinilata enzimaticamente, formando tetrameri quando incubata con streptavidina. Tuttavia, la proteina CD1 solubile può essere incubata fondamentalmente per tutta la notte in una soluzione contenente un glicolipide di interesse. È molto importante che il glicolipide non venga disciolto in DMSO, poiché è comune utilizzare DMSO come diluente o solvente per i glicolipidi, ma CD1 è molto sensibile a questo solvente.

Pertanto, utilizziamo tipicamente un buffer che contiene una piccola quantità di tween e PBS. Questo buffer si rivela molto efficace per solubilizzare la maggior parte dei nostri glicolipidi. Per il caricamento in CD 1D, che avviene spontaneamente, utilizziamo streptavidina proveniente da uno qualsiasi tra diversi produttori.

E si accoppia bene a PE, FITC, Eritrina o coloranti a base di ficocianina PC, uno qualsiasi di questi funziona molto bene e ci fornisce una colorazione di ottima qualità. Nel complesso, quindi, la procedura non è molto diversa dalle procedure ben caratterizzate per la produzione di tetramer di MHC classe I, tranne per il fatto che non utilizziamo un'espressione batterica, bensì un'espressione mediante virus batterici, e naturalmente impieghiamo antigeni lipidici anziché peptidici. Un punto che dovrei sottolineare è che gli esseri umani possiedono cellule NKT e queste hanno la stessa specificità delle cellule NKT del topo.

Pertanto, questa specificità esiste da almeno 60 milioni di anni, da quando ci siamo separati dai roditori, e in effetti produciamo tetrameri umani CD1D utilizzando le stesse tecniche che potete vedere nel video realizzato qui. Tuttavia, in realtà, le cellule T NK umane funzionano molto bene con i tetrameri murini e viceversa. Di conseguenza, non produciamo i tetrameri umani così spesso, semplicemente perché possiamo utilizzare i nostri tetrameri murini per studi sull'uomo.

Pertanto, esistono molti modelli murini in cui si è dimostrato che le cellule T NK sono determinanti fondamentali nell'esito della risposta immunitaria. Questo spettro comprende la risposta ai tumori, la regolazione delle malattie autoimmuni, l'eliminazione di agenti infettivi e persino lo sviluppo di placche aterosclerotiche, un processo infiammatorio cronico che si verifica nelle arterie.

C'è qualche dubbio sull'importanza di queste cellule nell'uomo, dove sono presenti in quantità leggermente minore; sono stati pubblicati numerosi rapporti che indicano come queste cellule siano alterate in condizioni autoimmuni e altri che segnalano un loro notevole arricchimento nei polmoni dei pazienti asmatici. Sebbene questi rapporti includano un articolo pubblicato sul New England Journal of Medicine, su questo argomento permane una certa controversia. Tuttavia, esistono diversi studi sull'uomo che suggeriscono come queste cellule potrebbero essere importanti.

In termini di studi clinici, la stimolazione delle cellule NKT è stata testata in quattro trial di fase uno su pazienti con cancro avanzato. E ci sono alcune evidenze di efficacia; ovviamente, queste persone sono molto malate e gli studi sono ancora in corso in diversi tipi di tumore. Inoltre, vi sono ricercatori interessati all'uso della terapia mediata da cellule NK T anche nelle malattie autoimmuni, anche se tale applicazione non ha ancora preso piede.

I tetrameri possono svolgere un ruolo in questi studi principalmente in termini di analisi di ciò che è accaduto alle cellule NKT dopo la terapia con agonisti. L'idea tipica consiste quindi nell'utilizzare agonisti glicolipidici o, in alcuni casi, persino antagonisti glicolipidici, che altri gruppi stanno sviluppando, a seconda della risposta e della condizione. E poi valutare cosa è accaduto alle cellule T NK, cosa che normalmente si farebbe con i tetrameri.

Un altro possibile utilizzo sarebbe l'espansione in vitro di cellule NKT umane. È abbastanza fattibile e del tutto possibile coltivare un elevato numero di cellule NKT umane in vitro, ad esempio mediante stimolazione antigenica, che può essere effettuata con tetramer o con cellule che esprimono i glicolipidi appropriati. Oltre all'uso di tetramer o di cellule, è necessario aggiungere citochine.

Tuttavia, in tali condizioni, è possibile espandere un gran numero di cellule T NK umane. E un altro gruppo almeno a Boston è interessato a questo tipo di terapia rispetto alla terapia basata su glicolipidi. Un'altra parte del mio laboratorio è impegnata nello studio dell'immunità mucosale.

La maggior parte degli immunologi si è concentrata sui linfociti o globuli bianchi presenti nei linfonodi e nella milza. Eppure, forse la maggioranza di questi cellule si trova effettivamente nella mucosa intestinale, un sito in cui ospitiamo anche tra 10¹⁴ e 10¹⁵ batteri. Dal punto di vista microbico, siamo quindi per lo più sterili, ma non a livello intestinale.

E anche nell'intestino abbiamo una vasta popolazione di globuli bianchi. Queste cellule possiedono proprietà uniche e, in effetti, sono state finora relativamente poco studiate. Disponiamo quindi di alcune indagini di base su queste cellule.

Ma studiamo anche un processo che definirei disregolazione immunitaria, a livello intestinale, che porta alla malattia infiammatoria intestinale, che è, in pratica, una malattia mediata dal sistema immunitario dell'intestino tenue o del colon, e che è nota come morbo di Crohn o colite ulcerosa. E sebbene svolgiamo alcuni studi sull'uomo, la maggior parte del nostro lavoro riguarda modelli murini. Disponiamo di modelli murini, che ritengo molto validi, per lo studio della disregolazione del sistema immunitario della mucosa che porta a sintomi simili al morbo di Crohn.

Stiamo studiando tale processo e anche i modi per interferire con esso, con l'obiettivo finale di sviluppare terapie migliori per i pazienti affetti da queste malattie immunomediate. In conclusione, potremmo riflettere brevemente su quale sarà l'evoluzione dell'immunologia nei prossimi 10 anni circa, anche se è davvero difficile prevedere a così lunga scadenza. Per quanto ciò possa sembrare sorprendente.

Ritengo che il sistema immunitario mucosale sia effettivamente uno dei principali settori inesplorati dell'immunologia. Anche se sempre più persone e un numero crescente di gruppi di alto profilo stanno sviluppando interesse per lo studio dell'immunologia mucosale. Credo che un altro settore che avrà un impatto notevole sia la genetica, in particolare la genetica umana: man mano che progrediremo, o dovrei dire avanziamo, verso il sequenziamento di 1.000 genomi umani, sarà davvero possibile condurre studi su singoli individui e valutare in che modo la variabilità del DNA influisce sulla risposta immunitaria.

Al momento, la maggior parte delle migliori indagini sui percorsi fondamentali coinvolge i roditori. I roditori, in particolare i topi, sono estremamente importanti per i nostri studi. Ma credo che in futuro, quando prenderemo in considerazione fenomeni autoimmuni complessi o altre condizioni che potrebbero verificarsi negli individui, saremo in grado di effettuare tali studi sulla base di polimorfismi genetici umani.

Saremo in grado di valutare i polimorfismi e poi utilizzare queste informazioni per cercare di prevedere come ciò influirà sulle risposte immunitarie, per poi progredire verso quello che io definirei, e che altri stanno chiamando, un approccio alle terapie immunitarie personalizzate o, in senso più ampio, alla medicina personalizzata. La genetica avrà quindi un impatto enorme. Disponiamo già di ottimi strumenti nella genetica del topo.

Possiamo eliminare qualsiasi gene desideriamo. Possiamo eliminare l'espressione di geni in tipi cellulari specifici. Possiamo fare cose straordinarie.

Ma penso che in futuro analizzeremo la risposta immunitaria e l'immunità dal punto di vista delle risposte umane.