Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Il nostro laboratorio studia il ruolo delle cellule natural killer nella salute e nelle malattie, con l'obiettivo di sfruttarne il potenziale per migliorare i trattamenti contro i tumori solidi e ematologici. Gli attuali saggi di citotossicità delle cellule NK mancano di standardizzazione tra diverse piattaforme e configurazioni. Questo protocollo fornisce metodi riproducibili di imaging in tempo reale e citometria a flusso per una valutazione accurata della citotossicità.

Per iniziare, preparare 10 millilitri di SYTOX Orange 2x diluendo la soluzione madre di SYTOX Orange in mezzo di coltura NK-92 in un tubo conico da 15 millilitri. Contare le cellule bersaglio utilizzando un contatore Luna dopo averle mescolate con il blu di tripano oppure impiegare qualsiasi metodo validato di conta cellulare basato sull'esclusione di colorante. Trasferire la quantità necessaria di cellule bersaglio in un tubo conico da 15 millilitri.

Centrifugare il tubo a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente e scartare il soprannatante. Successivamente, risospendere le cellule bersaglio a una concentrazione finale di 250.000 cellule per millilitro in mezzo 2X SYTOX Orange. Per preparare la cellula effettrice, valutare la vitalità e la concentrazione delle cellule NK-92 ed procedere solo se la vitalità è superiore all'80%, poiché una vitalità inferiore potrebbe influenzare le prestazioni del saggio.

Contare e trasferire il numero richiesto di cellule NK-92 in singole provette coniche da 15 millilitri. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule a una concentrazione finale di 500.000 cellule per millilitro. Preparare le diluizioni delle cellule effettrici aggiungendo 240 microlitri di cellule effettrici nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo per un rapporto effettrici:bersaglio di due a uno, e aggiungere 120 microlitri di mezzo nei pozzetti rimanenti.

Eseguire diluizioni seriali a raddoppio da un rapporto effettore:bersaglio di 2:1 a 0,25:1, mescolando accuratamente mediante pipettaggio almeno cinque volte e cambiando i puntali tra un trasferimento e l'altro. Successivamente, per allestire la co-coltura, procurarsi la piastra a 96 pozzetti con fondo piatto rivestita di polilisina. Immediatamente prima del trasferimento, risospendere accuratamente le cellule bersaglio ed effettore senza formare bolle, quindi aggiungere 100 microlitri di ciascuna sospensione cellulare nei pozzetti appropriati.

Quindi, aggiungere 200 microlitri di PBS nei pozzetti inutilizzati circostanti. Centrifugare la piastra a 100G per due minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra nel sistema di imaging cellulare in tempo reale.

Acquisire immagini ogni ora per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Verificare la qualità delle immagini dopo la prima scansione e regolare le impostazioni di acquisizione se necessario. Regolare la separazione spettrale per correggere l'effetto di spillover dell'SYTOX Orange nel canale verde.

Verificare che le cellule morte di colore arancione positive non vengano identificate erroneamente come cellule verdi positive. Per configurare l'analisi cellulare singola di cellule non aderenti, impostare il diametro dell'oggetto atteso a 15 micrometri per corrispondere al diametro cellulare approssimativo. Impostare la sensibilità della soglia e la sensibilità della trama su cinque e la sensibilità del bordo su 10 per facilitare la separazione degli aggregati cellulari.

Impostare l'intervallo del filtro per l'area dell'oggetto accettato da 50 a 2.000 micrometri quadrati per escludere detriti e oggetti di grandi dimensioni. Impostare l'eccentricità massima a 0,95 per escludere oggetti non cellulari. Ottenere cellule NK umane primarie coltivate per 16-24 ore.

Trasferire 500.000 cellule bersaglio in un tubo conico da 15 millilitri con fondo conico. Lavare le cellule una volta con 10 millilitri di PBS. Centrifugare le cellule a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere il soprannatante. Preparare una soluzione lavorativa di estere succinimidilico di carbossifluoresceina o CFSC a 0,5 micromolare in PBS diluendo un microlitro di soluzione madre di CFSE a cinque millimolari in 10 millilitri di PBS. Ri-sospendere il pellet ottenuto a circa un milione di cellule per millilitro nella soluzione di CFSE.

Incubare le cellule per 15 minuti a 37 gradi Celsius, avvolte in foglio di alluminio per proteggerle dalla luce. Quindi arrestare la reazione aggiungendo da cinque a dieci volumi di mezzo di coltura e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione delle cellule, risospendere il pellet cellulare a 250.000 cellule per millilitro in modo che 100 microlitri contengano 25.000 cellule.

Aggiungere 100 microlitri per pozzetto di cellule bersaglio nei pozzetti designati di una piastra rotonda da 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Piastrare ogni condizione in triplice replicato. Successivamente, preparare 200 microlitri di soluzione di anticorpo 4X in mezzo di coltura per cellule NK per ciascun anticorpo in prova e relativo controllo isotipico abbinato.

Trasferire le soluzioni di anticorpi in una piastra a pozzetti profondi. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di anticorpo in ciascun pozzetto contenente le cellule bersaglio e mescolare accuratamente aspirando e dispensando almeno cinque volte. Aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura delle cellule NK per pozzetto nei pozzetti di controllo senza anticorpo e mescolare accuratamente mediante pipettaggio.

Incubare la piastra per 25-30 minuti in condizioni standard di incubazione. Contare ed ottenere 200.000 cellule NK e procedere solo se la vitalità è maggiore o uguale al 75%. Ri-sospendere le cellule a 250.000 cellule per millilitro in 800 microlitri di coltura primaria di cellule NK umane. Aggiungere 50 microlitri per pozzetto di cellule NK nei pozzetti corrispondenti e mescolare accuratamente aspirando e dispensando almeno cinque volte.

Successivamente, pipettare 50 microlitri per pozzetto di mezzo di coltura nei pozzetti di controllo e mescolare accuratamente. Ispezionare attentamente la piastra rotonda a 96 pozzetti per verificare che tutti i pozzetti contengano 200 microlitri con livelli di menisco uniformi e assenza di bolle. Centrifugare la piastra per due minuti a 100G, quindi incubarla per 16-18 ore in condizioni standard di incubazione.

Centrifugare la piastra per cinque minuti a 300G e scartare il soprannatante. Lavare tutte le pozzette con 200 microlitri per pozzetta di buffer per la fluorescenza attivata dal sorting cellulare o buffer FACS. Preparare una miscela madre di anticorpi di superficie nel buffer FACS come indicato qui.

Risospendere le cellule in 50 microlitri per pozzetto di mix master di anticorpi e mescolare accuratamente aspirando e dispensando almeno cinque volte. Incubare la piastra per 15 minuti a quattro gradi Celsius, avvolta in foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Aggiungere 150 microlitri per pozzetto di buffer FACS.

Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in 100 microlitri per pozzetto di DAPI cinque micromolare nel buffer FACS. Procedere immediatamente all'acquisizione in citometria a flusso senza incubazione pre-acquisizione. Eseguire la citometria a flusso utilizzando lo strumento Cytek Aurora e registrare i canali di fluorescenza per CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI e qualsiasi altro fluorocromo aggiuntivo.

Durante la co-coltura, le cellule effettrici, le cellule bersaglio vive e le cellule morte sono state visualizzate mediante microscopia in tempo reale su cellule vive. Le cellule NK-92 con CAR2 e CAR3 hanno mostrato una cinetica di uccisione più rapida rispetto alle cellule NK-92 con CAR1, in particolare nei primi punti temporali e a parità di rapporto tra effettori e bersagli. L'uccisione delle cellule bersaglio è aumentata con rapporti effettori:bersaglio più elevati, incluso nelle cellule NK-92 di controllo, che hanno dimostrato citotossicità naturale.

Le cellule NK-92 CAR2 e CAR3 hanno dimostrato una maggiore potenza a rapporti effettore:bersaglio più bassi nei tempi successivi. Mentre un potenziamento della potenza a rapporti effettore:bersaglio intermedi è stato osservato nei tempi precedenti. Sono stati definiti tre parametri, KR50, KT50 e IKI-50, per quantificare la potenza delle cellule CAR-NK-92, la cinetica di uccisione e la performance citotossica complessiva tra le popolazioni effettore.

L'aggiunta di daratumumab da solo non ha ridotto la sopravvivenza delle cellule bersaglio, confermando che l'anticorpo non aveva alcun effetto diretto sulla vitalità delle cellule bersaglio in assenza di cellule effettrici. La co-coltura con cellule NK da sole ha ridotto la sopravvivenza delle cellule bersaglio a circa il 70%, indicando una citotossicità naturale di base. L'aggiunta di daratumumab ha ulteriormente ridotto la sopravvivenza cellulare a circa il 37%, coerentemente con una citotossicità mediata dall'anticorpo potenziata.

Al contrario, la condizione con controllo di isotipo ha mostrato una sopravvivenza di circa il 62%, paragonabile a quella della condizione con sole cellule NK. La degranulazione delle cellule NK è risultata minima nella coltura co-coltivata senza anticorpo e massima nella condizione trattata con daratumumab, pari a circa il 31%, mentre il controllo di isotipo ha mostrato una degranulazione intermedia pari a circa il 19%. Questo protocollo consente ai ricercatori di quantificare la citotossicità naturale delle cellule NK, valutare la potenza citotossica di progetti di CAR-NK contro i tumori e confrontare l'efficacia dell'ADCC di anticorpi monoclonali. Un aspetto fondamentale da considerare durante l'esecuzione di questo protocollo è mantenere un conteggio accurato e costante delle cellule NK e delle cellule bersaglio, nonché un'accurata pipettatura e semina, al fine di garantire risultati affidabili e interpretabili.

Studi futuri possono sfruttare questi protocolli per esplorare l'evasione immunitaria delle cellule NK, confrontare la suscettibilità tumorale e valutare nuove immunoterapie basate sulle cellule NK in diversi tipi di cancro.