Piattaforma analitica multimodale su un chip di imaging a risonanza plasmonica di superficie multiplexed per l'analisi di sottoinsiemi di vescicole extracellulari
17 marzo 2023
Questo articolo propone una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottoinsiemi di vescicole extracellulari. Il metodo si basa su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica, accoppiata con spettroscopia Raman, per qualificare bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray.
La natura complessa delle EV rende difficile riconoscere la sottopopolazione di interesse e questo protocollo può rilevarle con il loro fenotipo, profilo dimensionale e proprietà nanomeccaniche. Questa combinazione di tecnica è un metodo label-free, che ci consente di rilevare EV in tempo reale dai mezzi di condizione e dal plasma sanguigno. Questa tecnica consente di caratterizzare profondamente sottoinsiemi di nanoparticelle di interesse, al fine di essere utilizzate come bioindicatori di patologia, o anche utilizzate come nanoparticelle per la somministrazione di farmaci.
Poiché si tratta di un metodo molto sensibile, è imperativo prestare attenzione alla preparazione del biochip prima di iniettare il campione di interesse. Dopo aver rivestito e funzionalizzato i chip, incubare il biochip in una miscela di 200 millimolari di etile dimetilamminopropilcarbodiimide/N-idrossisuccinimide e 50 millimolari per litro di N-idrossisuccinimide per almeno 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Utilizzando lo spotter, aggiungere 300 nanolitri di soluzione di ligando e incubare il biochip sotto un bagno sonico per 30 minuti.
Lavare il biochip dall'alto con acqua ultrapura. Aggiungi una goccia di olio con lo stesso indice di rifrazione del prisma per creare uno strato sottile uniforme tra il biochip e il prisma e posizionalo delicatamente su un prisma con lo stesso indice di rifrazione del biochip. Per la risonanza plasmonica di superficie, montare il biochip sul sistema SPRi.
Vai al menu a discesa sul lato sinistro del software e fai clic sulla directory di lavoro. Trova l'immagine in cui sono visibili diversi punti e fai clic per selezionare questa immagine. Quindi scrivi il nome delle famiglie di liganti e fai clic sulla definizione di specie Finish.
Trascinare la linea nera con il cursore sull'angolo di lavoro ottimale. Fate clic su Sposta specchia su angolo di lavoro e selezionate un angolo di lavoro. Ora fai clic su Kinetics.
Poiché il software richiede all'utente di definire il controllo negativo, scegliere Nessun controllo negativo a questo punto. Iniettare albumina sierica di ratto a 50 microlitri al minuto per quattro minuti. Iniettare etanolammina a 20 microlitri al minuto per 10 minuti per disattivare i gruppi carbossilici ancora presenti e reattivi sulla superficie.
Successivamente, lavare il biochip iniettando 40 millimolari OG a 50 microlitri al minuto per quattro minuti. Iniettare le vescicole extracellulari ad una concentrazione specifica sul chip biofunzionalizzato seguendo la cinetica dell'interazione delle vescicole sui diversi punti, contemporaneamente. Determina anche il valore della riflettività e il livello di interazione.
Una volta stabilizzato, iniettare glutaraldeide sul chip per fissare le vescicole extracellulari nel punto in cui si trovano prima di eseguire l'imaging AFM. Allineare il biochip sulla parte superiore della maschera sul vetrino. Utilizzare la telecamera CCD sulla parte superiore dell'AFM per localizzare il cantilever nel punto corretto che deve essere scansionato.
Avviare l'acquisizione AFM in modalità di contatto da tre a cinque aree grandi e piccole. Quindi, trattare le immagini AFM con il software di elaborazione dati JPK selezionando prima il canale di altezza. Scegliere un adattamento polinomiale da sottrarre da ogni linea per ottenere linee di scansione raddrizzate.
Selezionate la soglia di altezza sui grani d'oro per eliminare la rugosità sulla superficie. Il modulo di estrazione dei grani segna i grani utilizzando una soglia di altezza di 8,5 nanometri. I biochip multiplexed sono stati analizzati dopo la passivazione dell'albumina.
Il chip senza default. Il chip con alcuni difetti, dovuti alla fusione di macchie, innesti deboli, o bolle o contaminanti. E viene mostrato un chip d'oro nudo senza microarray per esaminare l'adsorbimento di vescicole extracellulari sull'oro.
L'esperimento di cattura su un biochip multiplex ha mostrato buoni segnali di riflettività per diversi ligandi e un buon rapporto segnale-rumore per i diversi ligandi, poiché la risposta del controllo negativo era trascurabile. L'adsorbimento delle vescicole extracellulari dopo l'iniezione del campione di vescicola extracellulare ha mostrato un segnale di alta riflettività, suggerendo che quelle vescicole erano in grado di adsorbire e rimanere stabili sul chip d'oro. Dopo il carico di vescicole extracellulari, sono state generate le immagini AFM su larga e piccola scala delle vescicole extracellulari su biochip.
Una visione ravvicinata ad alta risoluzione consente la metrologia delle vescicole extracellulari. Il diametro effettivo delle vescicole extracellulari su un biochip variava da 30 a 300 nanometri, con una grande maggioranza intorno ai 60 nanometri. I risultati ottenuti in aria e liquido sono stati comparabili.
Lo spettro Raman delle vescicole extracellulari adsorbite su un chip nudo ha rivelato uno spettro chiaro, con picchi corrispondenti principalmente alle vibrazioni del metilene, che sono associate ai lipidi delle membrane delle vescicole extracellulari. È importante preparare rigorosamente il biochip per essere in grado di rilevare i veicoli elettrici in modo accurato e riproducibile. Metodi convenzionali come il Western blotting e l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle possono essere utilizzati per correlare e confermare fenotipi e modelli di dimensioni.
Inoltre, sono previste analisi multiomiche per approfondire ulteriormente la caratterizzazione molecolare delle EV e la potenziale discriminazione dei sottoinsiemi.
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Panoramica
Questo studio presenta una nuova piattaforma analitica multiparametrica per la caratterizzazione di sottoinsiemi di vescicole extracellulari (EV) ad alta produttività. La piattaforma combina metodi di biosensing multiplex con microscopia a forza atomica e spettroscopia Raman per analizzare le EV in tempo reale, concentrandosi sui loro fenotipi, profili dimensionali e proprietà nanomeccaniche.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Caratterizzazione delle vescicole extracellulari
- Tecniche analitiche multiparametriche
- Metodi di biosensing
Sfondo
- La complessità delle EV rende difficoltosa l'identificazione delle sottopopolazioni.
- Importanza delle EV come biomarcatori per patologie e per il rilascio di farmaci.
- Necessità di metodi di rilevamento sensibili in diversi campioni biologici.
Metodi Utilizzati
- Combina biosensing multiplexato, microscopia a forza atomica e spettroscopia Raman.
- Utilizza microarray biofunzionalizzati per la rilevazione in tempo reale di EV.
- Approccio senza marcatura per minimizzare le interferenze con la caratterizzazione degli EV.
Risultati principali
- La tecnica mostra un rilevamento efficace degli EV in base alle dimensioni e alla composizione.
- L'immagine ad alta risoluzione rivela un diametro degli EV compreso tra 30 e 300 nanometri, prevalentemente intorno ai 60 nanometri.
- Gli spettri Raman indicano una composizione della membrana lipidica, confermando l'efficacia del metodo.
Conclusioni
- Lo studio dimostra con successo un metodo affidabile per la caratterizzazione approfondita delle EV.
- Questo lavoro ha importanti implicazioni per la ricerca sui biomarcatori e le applicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La caratterizzazione di sottogruppi di vescicole extracellulari (EV) con elevata specificità e elevata produttività rappresenta una sfida fondamentale nella scoperta precoce di biomarcatori e nello sviluppo di piattaforme terapeutiche. La piattaforma analitica multimodale descritta integra biosensori multiplex, microscopia a forza atomica e spettroscopia Raman per fornire un profilo fenotipico e molecolare quantitativo e senza marcatura delle EV. Questa capacità aumenta la sicurezza predittiva nella validazione di biomarcatori basati sulle EV e supporta decisioni di portafoglio a rischio calibrato nella ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Consente un'analisi fenotipica approfondita e un profilo nanomeccanico delle sottopopolazioni di EV per la validazione degli obiettivi.
- Supporta la riduzione del rischio biologico distinguendo i sottoinsiemi di EV in base a dimensione, composizione e caratteristiche molecolari.
- Facilita l'indagine basata su ipotesi riguardo agli EV come bioindicatori rilevanti per le malattie.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara biochip multiplexati e convalidati per flussi di lavoro riproducibili di cattura e analisi degli EV.
- Fornisce letture quantitative in tempo reale delle interazioni e dei profili di adsorbimento degli EV.
- Standardizza le condizioni del saggio per consentire confronti affidabili tra campioni e tra ligandi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la caratterizzazione dei sottogruppi di EV alle strategie traslazionali dei biomarcatori per il monitoraggio delle malattie.
- Garantisce continuità dalla profilazione degli EV nella fase di scoperta alla validazione preclinica dei biomarcatori candidati.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica nello sviluppo di terapie e diagnostica basate sugli EV.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma multimodale collega la scoperta precoce, il screening e la ricerca traslazionale consentendo un'analisi completa dei sottoinsiemi di vescicole extracellulari (EV) provenienti da fluidi biologici.
- Biologia della Scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla e la riduzione del rischio meccanicistica attraverso un profilo multiplex quantitativo delle vescicole extracellulari (EV).
- Screening: Fornisce output di saggio riproducibili e privi di marcatori per la discriminazione dei sottogruppi di EV e la specificità dei ligandi.
- Analisi: Integra parametri morfomeccanici e letture molecolari per informare confronti incrociati tra condizioni e analisi statistiche.
- Ricerca Translazionale: Facilita l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica per diagnosi basate sulle vescicole extracellulari (EV).
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma analitica scalabile e riutilizzabile per diversi programmi di ricerca e sviluppo sulle vescicole extracellulari (EV).
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione di biomarcatori e candidati terapeutici derivanti dalle EV.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la produttività nei flussi di lavoro di analisi delle EV.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento/cessazione e riduce i rischi biologici in fase avanzata nei portafogli focalizzati sulle EV.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio di progetti di scoperta e traslazionali basati sulle EV.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche nel biosensing multiplex, nella microscopia a forza atomica (AFM) e nella spettroscopia Raman per un funzionamento ottimale della piattaforma.
- Richiede una preparazione e funzionalizzazione rigorose del biochip per garantire riproducibilità e sensibilità.
- Necessita di accesso a strumentazione avanzata e infrastrutture analitiche per la caratterizzazione ad alta risoluzione delle vescicole extracellulari (EV).
- Traggo beneficio da una standardizzazione intersettoriale dei protocolli saggistici e dei flussi di analisi dei dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse matrici biologiche o fonti di vescicole extracellulari, sfruttando la flessibilità della piattaforma.
