Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali
3 novembre 2023
Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione sincrona e la co-registrazione di eventi di segnalazione intracellulare e la secrezione di insulina e glucagone da parte di pseudoisole umane primarie utilizzando la somministrazione adenovirale di un biosensore ciclico di adenosina monofosfato (cAMP), un rivelatore di differenza di cAMP in situ (cADDis) e un sistema di microperifusione.
Il nostro laboratorio sta lavorando per comprendere, prevenire e invertire la disfunzione delle cellule beta e altre anomalie palpebrali nel diabete di tipo uno e di tipo due. I nostri studi si concentrano sulla patogenesi del diabete umano integrando studi sulla biologia del pancreas e delle palpebre umane e sulla salute e malattia. Gli occhielli umani sono strutture sferiche 3D e l'accesso alle cellule attraverso l'intero occhiello presenta alcune sfide sperimentali.
Ad esempio, quando si cerca di introdurre biosensori per comprendere la segnalazione delle cellule oculari, il nostro protocollo per le pseudo palpebre supera questa sfida eseguendo manipolazioni genetiche nello stato di singola cellula e aggregando queste cellule oculari umane trasdotte in pseudo palpebre per gli studi a valle. Il nostro sistema di pseudo palpebre ci consente di esprimere i biosensori in tutto l'occhiello, piuttosto che solo sulla superficie palpebrale. In combinazione con il nostro sistema di imaging di cellule vive e microperfusione, siamo in grado di misurare e co-registrare i processi intracellulari dinamici con la secrezione ormonale a valle.
Questo protocollo potrebbe essere applicato per rispondere a una serie di importanti domande scientifiche. Ad esempio, le strategie di silenziamento genico potrebbero essere combinate con questo approccio per comprendere l'impatto di un gene di interesse sulla funzione palpebrale e sulle vie di segnalazione associate, sia a livello globale che in modo autospecifico.
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Panoramica
Questo studio affronta la disfunzione delle cellule beta e le anomalie delle isole nel diabete, utilizzando un sistema modello di pseudoisole per l'acquisizione sincrona di segnalazione cellulare e secrezione ormonale. Il metodo impiega la somministrazione adenovirale di un biosensore per l'AMPc e un sistema di microperifusione per consentire l'analisi dinamica delle risposte di insulina e glucagone.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito di Ricerca
- Diabete di tipo 1 e di tipo 2
- Biologia degli isolotti umani
- Dinamica della segnalazione cellulare
Sfondo
- Le isole umane sono strutture sferiche che presentano difficoltà sperimentali.
- Il protocollo delle pseudoisole risolve tali difficoltà per un efficace introduzione dei biosensori.
- Comprendere la segnalazione delle isole è fondamentale per la ricerca sul diabete.
Metodi Utilizzati
- Consegna adenovirale per l'espressione del biosensore
- Modello primario umano di pseudoisole
- Sistema di microperifusione per la misurazione della secrezione ormonale
Risultati principali
- Co-registrazione riuscita della segnalazione intracellulare e del rilascio ormonale.
- Analisi abilitata degli effetti del silenziamento genico sulla funzione delle isole.
- Monitoraggio dinamico delle risposte secretorie in tempo reale.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un protocollo solido per esaminare il segnale ormonale delle isole.
- Ha implicazioni significative per la comprensione della biologia delle isole nel diabete.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il sistema di pseudoisole umane consente una valutazione sincrona e quantitativa della segnalazione intracellulare e della secrezione ormonale in cellule primarie di isole umane, affrontando un collo di bottiglia critico nella validazione degli obiettivi per il diabete. Permettendo la manipolazione genetica e l'integrazione di biosensori in tutta la struttura tridimensionale dell'isola, questa piattaforma aumenta la fiducia predittiva negli studi meccanicistici e supporta decisioni di portafoglio a rischio calibrato nella ricerca sulle malattie metaboliche. L'integrazione di tecniche di imaging su cellule vive e di flussi di microperifusione ne fa una capacità riutilizzabile per le fasi iniziali della scoperta e per i percorsi di ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando la trasduzione del segnale intracellulare alla secrezione ormonale nelle cellule delle isole pancreatiche umane.
- Facilita la riduzione del rischio biologico mediante silenziamento genico o chiarificazione del percorso basata su biosensori in un contesto tridimensionale fisiologicamente rilevante.
- Supporta la previsione affidabile e la validazione funzionale degli obiettivi per programmi su diabete e malattie metaboliche.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di pseudoisole validati per lo screening di composti e saggi meccanicistici successivi.
- Standardizza le condizioni del saggio per misurazioni riproducibili e quantitative della secrezione ormonale e della dinamica dei biosensori.
- Consente una valutazione scalabile e multiplex di interventi candidati in un modello rilevante per l'uomo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro alla biologia degli isolotti umani rilevante per le malattie, favorendo lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo la riduzione del rischio meccanicistica in tessuto umano primario.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio integrando letture funzionali e di segnalazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo sistema collega la fase iniziale della scoperta, la validazione del bersaglio e la ricerca preclinica, permettendo un'analisi guidata da ipotesi dei segnali e della funzione delle isole in un unico flusso di lavoro.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi meccanicistiche e la chiarificazione di vie metaboliche mediante letture sincrone di biosensori e ormoni.
- Screening: Fornisce modelli di pseudoisoletti pronti per saggi e riproducibili per la valutazione quantitativa di interventi.
- Analisi: Offre misurazioni dinamiche e quantitative del segnale di cAMP e della secrezione ormonale per confronti robusti tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le informazioni meccanicistiche ottenute in vitro alla biologia delle malattie umane, favorendo l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e adattabile per un uso ripetuto in diversi programmi di scoperta di malattie metaboliche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi del diabete.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi funzionali delle isole.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale integrando dati funzionali e di segnalazione.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione di asset per le malattie metaboliche con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di isolotti umani, nella manipolazione genetica e nell'imaging di cellule vive.
- Richiede l'accesso a microscopia confocale, sistemi di microperifusione e analisi quantitative degli ormoni.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei pseudoisolotti e dei protocolli sperimentali.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse fonti di donatori o modelli di malattia.
- La produttività e la scalabilità sono limitate dalla disponibilità del tessuto primario e dalla complessità tecnica.
