Un multi-parametrica Perifusion Sistema isolotto all'interno di un dispositivo Perifusion Microfluidic

In questa presentazione, illustreremo un sistema di perfusione palpebrale basato sulla microfluidica per la misurazione simultanea della secrezione dinamica di insulina, dell'afflusso di calcio e delle variazioni del potenziale mitocondriale negli isolotti pancreatici in risposta a secretagoghi dell'insulina. Il sistema di perfusione è composto da un dispositivo microfluidico a tre strati, pompe a siringa e un raccoglitore frazionario di insulina. L'afflusso di calcio e i potenziali mitocondriali indotti da secretagoghi vengono analizzati mediante un microscopio a fluorescenza.

Ciao, mi chiamo Ola, un Waller del laboratorio del Dottor Val Holter del Dipartimento di Chirurgia dei Trapianti dell'Università dell'Illinois a Chicago. Ciao, sono Don Lee, anch'io del Laboratorio di October. Ciao, sono Tricia Hart, anch'io del laboratorio del Dottor Al Holster.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'acquisizione simultanea di immagini delle palpebre mediante un gradiente lineare di glucosio. Abbiamo utilizzato questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'aspetto e la funzione degli occhielli. Cominciamo dunque.

Il dispositivo microfluidico utilizzato per questa procedura è assemblato a partire da tre strati di PDMS reticolato ottenuti mediante fotolitografia standard. Il primo strato, ottenuto da un master in silicone, presenta i pozzetti del dispositivo microfluidico che tratterranno delicatamente gli anellini al loro posto, profondi 150 micrometri e di diametro 500 micrometri. Il secondo strato presenta canali alti 500 micrometri e larghi due millimetri.

La parte centrale del canale è allargata per distribuire il flusso e migliorare lo scambio della soluzione all'interno del dispositivo; il pozzetto di scambio viene realizzato perforando un foro alto tre millimetri e largo sette millimetri al centro dello strato. Il terzo strato è una lastra spessa di PDMS. Per preparare questo strato, praticare piccoli fori su entrambi i lati, allineati con l'ingresso e l'uscita del canale.

Nel secondo strato, una volta generate tutte e tre le stratificazioni, il primo strato viene legato a una lamella di vetro con i pozzetti rivolti verso l'alto. Il secondo strato viene quindi legato al primo strato con l'interasse dei canali rivolto verso l'alto. Infine, il terzo strato viene legato al secondo strato.

Dopo che gli strati sono stati uniti, il dispositivo è pronto per essere utilizzato negli esperimenti. Utilizzando una siringa da 10 millilitri riempita con etanolo al 70% e collegata al porto di ingresso del dispositivo mediante tubo Tai, sterilizzare il dispositivo microfluidico facendo passare l'etanolo attraverso i canali del dispositivo. Successivamente, utilizzando lo stesso apparato, far passare acqua deionizzata per rimuovere l'etanolo.

Dopo aver sterilizzato il dispositivo, posizionarlo su un palco microscopico riscaldato utilizzando un tubo in teflon, collegare le pompe a siringa contenenti le soluzioni di glucosio ad alta e bassa concentrazione a un connettore a Y. Successivamente, collegare all'ingresso del dispositivo microfluidico. Collegare l'uscita del dispositivo microfluidico a un raccoglitore di frazioni.

Assicurarsi che il tubo sia appoggiato su una piastra riscaldata a 37 gradi Celsius. È molto importante mantenere le soluzioni alla temperatura fisiologica per tutta la durata dell'esperimento. Successivamente, utilizzare il programma LabVIEW per avviare il gradiente di glucosio che verrà perfuso attraverso la rete microfluidica durante l'esperimento.

Questo software varia la portata di due soluzioni di glucosio. Controllando le pompe a siringa, è possibile generare diversi profili di gradiente di glucosio, come profili lineari, a forma di campana e a forma quadrata. In questo esperimento, in confronto ai valori attesi calcolati, verrà utilizzato un gradiente lineare di glucosio compreso tra 2 millimolari e 25 millimolari, con una portata variabile di 0,01 millilitri al minuto delle due soluzioni di glucosio e una portata costante di 0,25 millilitri al minuto in ingresso al dispositivo dopo il mescolamento delle soluzioni.

Dopo aver selezionato il profilo di gradiente appropriato, verificarne la stabilità. In primo luogo, avviare il sistema di gradiente. Successivamente, avviare il frazionatore e raccogliere otto frazioni da un millilitro in provette.

Quindi, utilizzando un glucometro, verificare la concentrazione di glucosio in ogni provetta usando Excel. Analizzare i risultati ottenuti dal glucometro. Successivamente, sostituire la siringa con elevata concentrazione di glucosio con una siringa contenente una soluzione di BSA al 0,5% in tampone Krebs-Ringer ed erogare 50 millilitri attraverso il dispositivo a una velocità di un millilitro al minuto.

Questo impedirà l'assorbimento non specifico dell'insulina sulle pareti dei microcanali, garantendo accuratezza durante la successiva misurazione dei livelli di insulina secreta dopo la perfusione con BSA. Sostituirlo con la soluzione ad alto contenuto di glucosio reus. Sospendere da 25 a 30 isolotti pancreatici di topo, selezionati manualmente, in un buffer di Krebs-Ringer contenente glucosio a due millimoli e i coloranti indicatori: fura 2:00 AM per il calcio e rhodamina 1 2 3 per i potenziali mitocondriali; incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, scollegare il dispositivo dal sistema di perfusione e caricare con attenzione le camere con le isole inserendo la punta della pipetta, contenente le isole, nel porto di ingresso, quindi rilasciare lentamente le isole. Dopo il caricamento, ricollegare il dispositivo al sistema di perfusione, avendo cura di non introdurre bolle d'aria. Successivamente, avviare la pompa a siringa per iniziare la perfusione delle camere con KRB contenente due millimoli di glucosio.

Questo passaggio rimuoverà il colorante in eccesso dal mezzo, permetterà di impostare i set di filtri di eccitazione e di emissione e i tempi di esposizione da utilizzare durante l'esperimento. Quindi impostare il raccoglitore frazionario in modo da raccogliere frazioni a intervalli di un minuto mentre si utilizzano gli occhielli con la soluzione a basso contenuto di glucosio. Utilizzare lo strumento di area di interesse o ROI del software di imaging Simple PCI per definire le aree o gli occhielli che si desidera acquisire.

Inoltre, cerchiare l'area di fondo che verrà sottratta dopo che le cellule sono state lavate per 10 minuti, avviare il frazionatore a gradiente di glucosio e iniziare l'acquisizione di immagini in time-lapse. Dopo 30 minuti, spegnere il software e la pompa a siringa di glucosio ad alta concentrazione. Continuare la perfusione con glucosio a bassa concentrazione per eliminare l'effetto del glucosio ad alta concentrazione.

Dopo 10 minuti, arrestare il flusso di glucosio basso spegnendo la pompa a siringa. Al termine della perfusione, esportare i dati in Excel per l'analisi. La quantità di insulina secreta nella perfusione può essere determinata mediante ELA occhielli per mouse.

Sono stati perfusi con un gradiente lineare di glucosio da 2 a 25 millimolari come mostrato qui. L'ingresso di calcio e la secrezione di insulina vengono innescati dopo circa 13 minuti di perfusione, corrispondenti a 6 millimolari di glucosio. Le variazioni dei potenziali mitocondriali si osservano in anticipo, come previsto, dopo circa 11 minuti.

Questi dati dimostrano il vantaggio dell'utilizzo di questa rete microfluidica per caratterizzare la fisiologia degli occhielli. Vi abbiamo appena mostrato come utilizzare il nostro dispositivo microfluidico per la parafusione nello studio della fisiologia degli occhielli. Quando si esegue questa procedura, è importante assicurarsi che non vi siano bolle nel dispositivo, poiché potrebbero causare lo spostamento degli occhielli durante l'esperimento.

Inoltre, il flusso può essere regolato fino a un ml al minuto senza disturbare gli occhielli. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.