Valutazione rapida della citotossicità in vitro del recettore dell'antigene chimerico che esprime Jurkat mediante imaging fluorescente
27 ottobre 2023
Un protocollo per valutare l'uccisione quantitativa delle cellule tumorali da parte delle cellule Jurkat che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) mirato all'antigene tumorale singolo. Questo protocollo può essere utilizzato come piattaforma di screening per una rapida ottimizzazione dei costrutti di cerniera CAR prima della conferma nelle cellule T derivate dal sangue periferico.
Le cellule CAR-T vengono costantemente migliorate per ottenere risposte migliori negli studi clinici sull'uomo. Stiamo identificando modi per valutarlo nel nostro laboratorio utilizzando un metodo imparziale ad alto rendimento, come l'utilizzo di imaging fluorescente per selezionare le combinazioni che funzionano meglio. Esistono diverse combinazioni di costrutti che possono essere progettate per ogni singolo frammento variabile a catena modificando la geometria dei domini extracellulari e cerniera.
Abbiamo progettato questo protocollo per identificare le combinazioni con la migliore efficacia nell'eliminazione delle cellule bersaglio utilizzando le cellule Jurkat. Si tratta di un protocollo rapido e ad alto rendimento per lo screening dei costrutti CAR in base alla citotossicità delle cellule bersaglio utilizzando cellule Jurkat, che vengono poi convalidate con cellule T convenzionali. Una dozzina di diversi costrutti CAR possono essere testati contemporaneamente in una piastra a 96 pozzetti utilizzando questa tecnica.
Qui nel laboratorio di Akhavan, quantifichiamo in numeri assoluti la ciclosi diretta delle cellule bersaglio da parte delle cellule Jurkat che esprimono CAR in modo ad alto rendimento per lo screening di più costrutti CAR. L'obiettivo primario del nostro laboratorio è quello di migliorare la traduzione clinica della terapia con cellule CAR-T contro i tumori cerebrali di alto grado. Sfruttiamo gli screening farmacologici ad alto rendimento come modalità per migliorare la citotossicità delle cellule CAR-T, oltre a mirare al microambiente tumorale.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo ad alto rendimento per valutare la citotossicità di cellule Jurkat esprimenti recettori a antigeni chimerici (CAR) nei confronti di cellule tumorali. Consente lo screening rapido di diverse costruzioni di CAR per identificare le combinazioni più efficaci nel mirare antigeni tumorali specifici.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Immunologia
- Biologia del Cancro
- Terapia Cellulare
Sfondo
- Le cellule CAR T vengono perfezionate per migliorare i risultati clinici.
- I metodi di screening ad alto rendimento sono essenziali per ottimizzare le costruzioni CAR.
- Le cellule Jurkat fungono da modello per valutare l'efficacia del CAR.
- Questo studio si concentra sulla citotossicità delle costruzioni CAR nei confronti delle cellule bersaglio.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per lo screening efficiente di costrutti CAR.
- Quantificare gli effetti citotossici di cellule Jurkat esprimenti CAR.
- Identificare configurazioni ottimali di CAR per il targeting di antigeni tumorali.
Metodi Utilizzati
- Imaging fluorescente per lo screening ad alto rendimento.
- Valutazione di multipli costrutti CAR in un formato a piastra da 96 pozzetti.
- Quantificazione della lisi delle cellule bersaglio da parte di cellule Jurkat esprimenti CAR.
- Confronto con le risposte convenzionali delle cellule T per la validazione.
Risultati principali
- Identificazione di costrutti CAR efficaci per l'uccisione delle cellule tumorali.
- Dimostrazione delle capacità ad alto rendimento mediante l'uso di cellule Jurkat.
- Valutazione quantitativa della citotossicità tra diversi costrutti.
- Potenziale per un'ottimizzazione rapida dei disegni dei costrutti CAR prima dell'applicazione clinica.
Conclusioni
- Il protocollo consente uno screening efficiente delle costruzioni CAR.
- Le cellule Jurkat forniscono un modello affidabile per valutare l'efficacia del CAR.
- Questo approccio può accelerare lo sviluppo delle terapie con cellule T CAR.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione rapida ad alto rendimento della citotossicità di costrutti CAR in cellule Jurkat consente una riduzione precoce dei rischi e la priorizzazione delle progettazioni CAR prima della validazione in linfociti T primari, che richiede maggiori risorse. Questa piattaforma accelera l'identificazione di CAR con cerniera ottimizzata che mostrano un'efficace eliminazione delle cellule bersaglio, favorendo una selezione efficiente del portafoglio nelle linee produttive di terapie cellulari oncologiche. Quantificando la citotossicità su più costrutti contemporaneamente, i team possono prendere decisioni basate sui dati in punti critici di svolta della fase scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente un'analisi rapida delle permutazioni del costrutto CAR per la validazione funzionale dell'obiettivo.
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica quantificando la citotossicità diretta in un sistema controllato.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione del costrutto prima dell'ingegnerizzazione dei linfociti T primari.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi CAR-Jurkat validati per flussi di lavoro di screening ad alto rendimento successivi.
- Standardizza saggi di citotossicità con uscite quantitative mediante imaging fluorescente.
- Permette una valutazione riproducibile e scalabile di multipli costrutti CAR in parallelo.
- Supporta la valutazione affidabile di composti o costrutti in formati di piastre a 96 pozzetti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati precoci di citotossicità agli obiettivi traslazionali confermando i risultati in linfociti T derivati da PBMC.
- Garantisce continuità dalle fasi iniziali di ottimizzazione del costrutto fino ai passaggi di validazione preclinica.
- Riduce il rischio di fallimento in fasi avanzate filtrando precocemente i disegni di CAR subottimali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma ad alto rendimento per la citotossicità si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale di scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, collegando la progettazione dei costrutti alla validazione preclinica. Consente un rapido test delle ipotesi e la selezione dei costrutti prima di procedere verso studi più impegnativi dal punto di vista delle risorse, come quelli con linfociti T primari o studi in vivo.
- Biologia della scoperta: Supporta la valutazione basata su ipotesi di modifiche nell'area cerniera e nei domini extracellulari per l'efficacia del CAR.
- Screening: Fornisce dati quantitativi e riproducibili di citotossicità per il confronto e il ranking dei costrutti.
- Analisi: Fornisce conteggi cellulari assoluti e risultati statistici (ad esempio, ANOVA ad un fattore) per supportare il processo decisionale.
- Ricerca traslazionale: Conferma le prestazioni del costrutto in linfociti T derivati da PBMC, sostenendo la continuità traslazionale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma scalabile e riutilizzabile per campagne continue di ottimizzazione dei costrutti CAR.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella selezione dei costrutti CAR.
- Valore operativo: Standardizza e scala la valutazione della citotossicità, consentendo un'allocazione efficiente delle risorse.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale filtrando precocemente i costrutti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento dei candidati CAR con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di costrutti CAR e nella trasduzione lentivirale di cellule Jurkat.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per imaging fluorescente e a software analitici per letture quantitative.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per l’impostazione del saggio e i parametri di analisi dati.
- L’adattamento ad altri modelli cellulari o antigeni potrebbe richiedere un’ottimizzazione del protocollo.
- Dipende da un’analisi statistica solida (ad esempio, ANOVA) per il confronto tra costrutti.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
