Fabbricazione di griglie monostrato rivestite di grafene per microscopia crioelettronica
8 settembre 2023
Qui, descriviamo un protocollo per l'applicazione di un singolo monostrato di grafene alle griglie di microscopia elettronica e come prepararle per l'uso nella determinazione della struttura crioEM.
Attualmente, la conservazione ottimale dei campioni biologici è una sfida importante per ottenere strutture CryoEM ad alta risoluzione. Durante il processo di preparazione del campione, i campioni sono esposti all'interfaccia idrofobica aria-acqua, che ha effetti denaturanti sui campioni e può far sì che i campioni stabili adottino un orientamento preferenziale nel ghiaccio, impedendo la determinazione della struttura ad alta risoluzione. Il rivestimento delle griglie CryoEM con un sottile strato di carbonio simile all'ossido di grafene molle è stato comunemente utilizzato per risolvere i problemi relativi alle interazioni con l'interfaccia aria-acqua.
Tuttavia, questi strati spesso aumentano il rumore di fondo nelle nostre immagini, che compromette le risoluzioni della nostra struttura. Rivestendo la griglia con un monostrato di grafene si ottiene una protezione simile senza introdurre un rumore di fondo significativo. L'utilizzo di griglie CryoEM rivestite di grafene può aiutare a superare i problemi legati alle interazioni con l'interfaccia aria-acqua, tuttavia, le griglie di grafene commerciali sono costose e molti laboratori considerano le griglie di grafene troppo complicate da preparare internamente.
I ricercatori nel campo di CryoEM possono ora utilizzare questo protocollo passo-passo per riprodurre dozzine di grafeni di alta qualità completamente prodotti in un giorno.
Panoramica
Questo studio affronta la sfida della conservazione ottimale di campioni biologici per la microscopia elettronica criogenica ad alta risoluzione (cryo-EM). Gli autori presentano un protocollo per rivestire le griglie EM con un singolo monostato di grafene al fine di ridurre al minimo il rumore di fondo e migliorare l'integrità del campione durante l'acquisizione delle immagini.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Microscopia elettronica criogenica
- Conservazione del campione nell'imaging biologico
- Applicazioni del grafene nella microscopia
Sfondo
- La conservazione dei campioni biologici è fondamentale per ottenere strutture ad alta risoluzione mediante microscopia elettronica criogenica.
- I tradizionali rivestimenti in carbonio possono aumentare il rumore di fondo nell'immagine.
- Il grafene fornisce uno strato protettivo senza compromettere la qualità dell'immagine.
Metodi Utilizzati
- Applicazione di un monostrato di grafene su griglie per microscopia elettronica
- Tecniche di imaging criogenico per microscopia elettronica
- Utilizzo di spin coater fatti in casa e di diversi agenti pulenti
Risultati principali
- Le griglie rivestite con grafene mostrano un rumore di fondo ridotto nell'imaging.
- Il metodo consente la produzione su larga scala di grafene di alta qualità in un singolo giorno.
- Le griglie per microscopia elettronica dimostrano un'efficace conservazione e concentrazione di campioni biologici.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un approccio semplice per la produzione in laboratorio di griglie per microscopia elettronica rivestite con grafene.
- Questo progresso aumenta il potenziale di un'immagine migliorata in microscopia elettronica criogenica nella ricerca biologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La criomicroscopia elettronica ad alta risoluzione è fondamentale per la biologia strutturale e la scoperta di farmaci, ma la denaturazione del campione e il bias di orientamento all'interfaccia aria-acqua limitano la qualità dei dati e la produttività. Le griglie rivestite con un monolayer di grafene risolvono questi colli di bottiglia preservando l'integrità delle macromolecole e riducendo il rumore di fondo, influenzando direttamente la fase iniziale della scoperta e la validazione dei bersagli. La fabbricazione in sede scalabile delle griglie di grafene ne permette un'adozione più ampia, sostenendo studi strutturali su tutta la linea di prodotti e accelerando la riduzione del rischio meccanicistico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi strutturale ad alta fedeltà di complessi macromolecolari per la validazione degli obiettivi.
- Riduce la denaturazione e l'aggregazione, favorendo la riduzione dei rischi meccanicistici nelle fasi iniziali della scoperta.
- Migliora la diversità di orientamento, aumentando l'affidabilità predittiva dei modelli strutturali.
Sviluppo di screening e saggi
- Semplifica la preparazione di griglie per criomicroscopia elettronica riproducibili e a basso rumore di fondo per analisi successive.
- Permette un'analisi quantitativa delle immagini riducendo al minimo il rumore e gli artefatti di concentrazione.
- Consente una valutazione affidabile di complessi proteici a concentrazioni campione più basse.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Migliora la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica grazie alla generazione di dati strutturali robusti.
- Si allinea allo sviluppo traslazionale di biomarcatori mediante una risoluzione strutturale migliorata.
- Riduce il rischio di fallimenti in fasi avanzate dovuti a dati strutturali ambigui o compromessi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
I griglie rivestite con grafene monocristallino si integrano nel flusso di lavoro della microscopia crioelettronica dalla fase iniziale di scoperta fino all'identificazione dei composti promettenti e alla ricerca preclinica, sostenendo studi strutturali guidati da ipotesi e permettendo acquisizioni di immagini riproducibili e di alta qualità.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mantenendo le conformazioni native delle macromolecole.
- Screening: Fornisce griglie standardizzate e riproducibili per saggi quantitativi di criomicroscopia elettronica.
- Analisi: Offre immagini ad alta risoluzione e a basso rumore per analisi comparative affidabili.
- Ricerca traslazionale: Migliora la continuità preclinica consentendo una caratterizzazione strutturale affidabile dei candidati terapeutici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma scalabile ed economicamente efficiente per studi strutturali ripetuti in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica in biologia strutturale.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione delle griglie, migliora la riproducibilità e consente la scalabilità in lotti.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce i rischi biologici in fasi avanzate grazie a dati di maggiore qualità.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di target validati strutturalmente in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione delle griglie per criomicroscopia elettronica e nel trattamento del grafene.
- Necessita dell'accesso a centrifughe per rivestimenti, cappe a flusso laminare e infrastrutture standard per la preparazione delle griglie per microscopia elettronica.
- Richiede una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per ottenere una qualità delle griglie e risultati di imaging riproducibili.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse classi di proteine o tipi di campioni.
- Le limitazioni potenziali includono la sensibilità nella manipolazione e la formazione iniziale necessaria per i passaggi di trasferimento del grafene.
