Preparazione di nuclei cerebrali e del midollo osseo di alta qualità per saggi multiomi a nucleo singolo
22 dicembre 2023
Il successo della trascrittomica e della multiomica a singola cellula/singolo nucleo dipende in gran parte dalla qualità delle cellule/nuclei. Pertanto, l'isolamento di cellule/nuclei dai tessuti e la loro purificazione devono essere altamente standardizzati. Questo protocollo descrive la preparazione di nuclei dal cervello e dal midollo osseo per il test multioma a singolo nucleo a valle.
L'Unità Tecnologica di Citometria e Biomarcatori supporta progetti biomedici attraverso tecnologie e pipeline all'avanguardia per la fenotipizzazione cellulare e la profilazione molecolare con risoluzione a singola cellula. In questo contesto, utilizziamo diversi strumenti per l'analisi multiomica di singole cellule per ottenere informazioni sull'espressione genica e sulla regolazione genica in salute e malattia. La citometria a flusso identifica e individua le singole cellule in base a caratteristiche uniche.
I recenti progressi includono selezionatori spettrali ad alta produttività, basati su immagini, e queste tecnologie offrono flessibilità nella progettazione del pannello, consentono l'uso simultaneo di coloranti simili e la gestione dell'autofluorescenza. Una delle principali sfide sperimentali quando si utilizzano tecnologie all'avanguardia a cellula singola è quella di lavorare con popolazioni cellulari particolarmente fragili o rare. Ogni tessuto o tipo di cellula deve essere sottoposto a un'ottimizzazione del protocollo per ottenere un numero sufficiente di cellule altamente vitali che si traducono in dati di sequenziamento di alta qualità.
Il nostro protocollo di preparazione dei singoli nuclei modificato migliora il recupero dei nuclei e riduce al minimo lo stress sui nuclei. È specificamente ottimizzato per i tessuti cerebrali e del midollo osseo e copre tutte le fasi, dalla dissociazione del campione alla purificazione dei nuclei.
Panoramica
Questo studio si concentra sull'ottimizzazione dell'isolamento di nuclei da tessuti cerebrali e del midollo osseo per analisi multiomiche a livello di singolo nucleo. Viene sottolineata l'importanza dell'estrazione di nuclei di alta qualità a causa del suo impatto sulle analisi trascrittomica a singola cellula e multi-omica.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Trascrittomica a singola cellula
- Multi-omica
- Tecniche di isolamento dei nuclei
Sfondo
- Il successo della trascrittomica dipende dalla purezza e qualità delle cellule/nuclei isolati.
- I recenti progressi nella citometria a flusso e nelle tecnologie basate su immagini potenziano le capacità di ordinamento cellulare.
- Sono necessarie considerazioni specifiche per popolazioni cellulari fragili o rare, che richiedono protocolli ottimizzati.
Metodi Utilizzati
- Protocollo modificato per la preparazione di nuclei da tessuti cerebrali e del midollo osseo
- Sistema modello murino
- Le tecniche includono la citometria a flusso e il conteggio cellulare automatizzato
Risultati principali
- Tassi migliorati di recupero dei nuclei con stress minimo durante la preparazione.
- La purezza dei nuclei cerebrali è aumentata dal 36% a quasi il 100% dopo il sorting.
- È stato stabilito un flusso di lavoro affidabile per preparare i nuclei per dati di sequenziamento di alta qualità.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un protocollo efficace per l'isolamento di nuclei ad alta purezza da tessuti specifici.
- I risultati hanno implicazioni significative per il miglioramento delle analisi multiomiche a singola cellula nella ricerca su salute e malattia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La preparazione di nuclei di alta qualità da cervello e midollo osseo è fondamentale per saggi multiomici robusti a livello di singolo nucleo, influenzando direttamente l'affidabilità del profilo trascrittomico ed epigenetico nelle fasi iniziali della scoperta. Protocolli standardizzati per l'isolamento dei nuclei consentono una generazione di dati coerente, sostenendo la fiducia predittiva e la riduzione dei rischi meccanicistici negli studi su tessuti complessi. Questa capacità è fondamentale per far progredire modelli pertinenti alle malattie e accelerare le decisioni di portafoglio nella ricerca in neurobiologia e ematologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi degli stati trascrittionali ed epigenetici specifici per tipo cellulare in tessuti complessi.
- Supporta la validazione funzionale degli bersagli fornendo nuclei di alta integrità per letture multiomiche.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici attraverso una preparazione campionaria riproducibile e una qualità dei dati costante.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce sospensioni di nuclei validate ottimizzate per flussi di lavoro multiomici 10X Genomics a valle.
- Migliora la riproducibilità e la standardizzazione del saggio riducendo al minimo la variabilità del campione.
- Consente la preparazione scalabile di librerie di nuclei per schermature ad alto rendimento di composti o perturbazioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli di tessuti pertinenti alle malattie per la scoperta traslazionale di biomarcatori.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mantenendo la qualità dei nuclei attraverso esperimenti diversi.
- Riduce il rischio di artefatti tecnici che potrebbero confondere l'interpretazione dei dati preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di preparazione dei nuclei si integra nell'interfaccia tra elaborazione dei tessuti e sequenziamento multiomico a singolo nucleo, supportando flussi di lavoro dalla scoperta iniziale alla ricerca preclinica.
- Biologia della scoperta: Fornisce nuclei di alta qualità per la verifica di ipotesi e l'analisi di percorsi biologici in tessuti cerebrali e del midollo osseo.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio per piattaforme di profilazione multiomica.
- Analisi: Fornisce metriche quantitative sulla qualità dei nuclei per guidare l'analisi successiva dei dati e il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori e la fedeltà del modello di malattia preservando l'integrità dei nuclei.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato e riutilizzabile, adattabile a diversi tipi di tessuto e studi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi multiomici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro di isolamento dei nuclei.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale garantendo dati di ingresso affidabili.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di programmi di neurobiologia e di ematologia con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissociazione dei tessuti, nell'isolamento dei nuclei e nella valutazione del controllo qualità.
- Necessita dell'accesso alla citometria a flusso, al conteggio cellulare automatizzato e alle infrastrutture per il sequenziamento.
- Richiede una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità tra studi e siti.
- Potrebbe richiedere l'adattamento del protocollo per diversi tipi di tessuto o specie.
- Dipende dal mantenimento della vitalità e integrità dei nuclei durante tutte le fasi di lavorazione.
