Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Per studiare le interazioni tra cromatina e DNA che regolano l'espressione genica specifica dei neuroni nel cervello umano, è necessario innanzitutto ottenere una popolazione pura di nuclei neuronali. Il tessuto cerebrale umano post mortem viene omogeneizzato e i nuclei totali sono isolati mediante centrifugazione in gradiente di densità. Successivamente, i nuclei vengono marcati con anticorpi specifici per i neuroni e isolati tramite sorting in citometria a flusso, per poi essere infine concentrati mediante ultracentrifugazione.

Ciao, sono Anish Matan del laboratorio della dottoressa Sharon mc Barian, presso il dipartimento di psichiatria della University of Massachusetts Medical School. Oggi vi mostrerò una procedura per l'isolamento di nuclei neuronali da tessuto cerebrale umano post mortem. Cominciamo.

Per ogni campione di nuclei da separare, partire da mille milligrammi di tessuto cerebrale post mortem congelato. Con questa quantità, è possibile ottenere circa 5 milioni di nuclei neuronali dopo la separazione attivata da fluorescenza. Per iniziare l'estrazione dei nuclei, inserire 250 milligrammi di tessuto cerebrale in un douncer contenente cinque millilitri di buffer di lisi e porre il tutto sul ghiaccio.

Una volta scongelato il tessuto, lasciarlo in ghiaccio per un minuto. Dopo questa fase, trasferire il tessuto omogeneizzato in un tubo trasparente da ultracentrifuga da 15 ml e quindi mettere il tubo in ghiaccio. Ripetere questa omogeneizzazione per il tessuto rimanente.

Successivamente, pipettare con attenzione nove millilitri di soluzione di saccarosio sul fondo delle provette per ultracentrifuga, in modo da creare un gradiente di concentrazione per cui la soluzione di tessuto omogeneizzato si trovi sopra la soluzione di saccarosio. A questo punto, pesare le provette per ultracentrifuga per assicurarsi che siano bilanciate durante l'ultracentrifugazione. Apportare eventuali correzioni al peso aggiungendo buffer di lisi allo strato superiore. Dopo aver pesato le provette, posizionarle nell'ultracentrifuga utilizzando il rotore SW 28 e centrifugare i campioni a 107163,6 RCF per 2,5 ore a quattro gradi.

Al termine della centrifugazione, aspirare il surnatante e anche lo strato di detriti presente nel gradiente di concentrazione. Avere cura di non disturbare il pellet sul fondo della provetta, che contiene i nuclei. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di un XPBS a ciascun pellet e lasciare in ghiaccio per 20 minuti.

Dopo 20 minuti, risospendere i pellet aspirando e dispensando con una pipetta. L'incubazione sul ghiaccio permette ai pellet di sciogliersi leggermente autonomamente, il che facilita la risospensione dei nuclei, riducendo così la quantità di stress cui i nuclei sono sottoposti. Successivamente, trasferire la risospensione e i nuclei in due provette da centrifuga da 2 ml.

Combinare la soluzione nucleica proveniente da due delle provette per ultracentrifuga in ciascuna provetta microcentrifuga e, nuovamente, posizionare i campioni sul ghiaccio. Ora che l'estrazione degli acidi nucleici è completa, passerò al passaggio di immunomarcatura al fine di isolare i nuclei neuronali mediante sorting FACS. Il campione contenente i nuclei verrà incubato con una miscela per immunomarcatura composta da anticorpi primari e secondari, nonché da agenti bloccanti. Per preparare la miscela per immunomarcatura, aggiungere 1,2 microlitri di anticorpo specifico per neuroni, NeuN, a 300 microlitri di PBS 1X. Quindi aggiungere 100 microlitri di miscela bloccante, che contiene BSA allo 0,5% e siero normale di capra al 10% in PBS 1X.

Infine, aggiungere un microlitro dell'anticorpo secondario chiamato LOR 4 88. Preparare anche una colorazione immunoistochimica per un campione di controllo negativo utilizzando questa miscela di colorazione immunoistochimica. Escludere l'anticorpo primario new end e sostituirlo con 1,2 microlitri di 1 XPBS.

Ora vortexare le miscele di immunomarcatura e incubarle per cinque minuti a temperatura ambiente al buio mentre le miscele di colorazione sono in incubazione. Preparare i campioni di nuclei di controllo per il campione negativo: aggiungere 20 microlitri della sospensione di nuclei resuspensi in un tubo da 2 ml contenente 980 microlitri di PBS 1X. Preparare anche un controllo non colorato, contenente solo la soluzione di nuclei e PBS.

Ora eluare 20 microlitri dei nuclei in un altro tubo e riportare il volume a un millilitro con 1x PBS. Quindi riporre tutti i campioni sul ghiaccio. A questo punto, le miscele per la colorazione immunoistochimica sono pronte.

Incubare aggiungendo 401 microlitri della miscela al campione appropriato. Il campione di nuclei ha ricevuto la miscela contenente sia il nuovo anticorpo sia LOR 4 88. Il campione di controllo negativo ha ricevuto una miscela contenente solo l'anticorpo secondario LOR 4 88, mentre nessun colorante immuno è stato aggiunto al campione di controllo non colorato.

Successivamente, trasferire i campioni nel coldron e ruotarli al buio per 45 minuti. Ora che l'incubazione di 45 minuti è terminata, porterò i campioni presso la struttura centrale di citometria a flusso della University of Massachusetts Medical School per eseguire un'analisi di sorting attivata da fluorescenza. Durante il trasporto alla struttura centrale, i campioni devono essere mantenuti sul ghiaccio e al buio. Presso la struttura centrale di citometria a flusso, i campioni vengono prima filtrati attraverso un filtro da 40 micron e poi analizzati con lo strumento per alcuni minuti, mantenendoli freddi.

Questo viene fatto per ottenere alcuni dati preliminari prima del sorting. Il controllo non colorato stabilisce il grado di fluorescenza negativa. Sulla base di queste informazioni, regolare la sensibilità della macchina alla fluorescenza.

Il controllo colorato viene utilizzato per controllare l'influenza. Eventuali rumori di fondo dovuti alla fluorescenza in questo punto stabiliscono i parametri appropriati necessari per l'ordinamento. Vengono utilizzati diversi parametri per ordinare i campioni.

Ecco alcuni dati tipici per la prima porta. Questo grafico di analisi FACS mostra un campione rappresentativo dopo che la porta è stata regolata. La prima porta riconosce schemi di detriti e nuclei vitali sulla base di una combinazione di impostazioni come la fluorescenza e l'esperienza visiva generale.

L'asse x rappresenta lo scatter in avanti, che corrisponde alla dimensione relativa, mentre l'asse Y rappresenta lo scatter laterale, che indica la complessità interna come la granulosità. La prima finestra fornisce anche un'indicazione della dimensione dei diversi nuclei presenti nel nostro campione. Questo permette di separare i detriti dai nuclei effettivi, ed ecco alcuni dati tipici della seconda finestra.

Questo grafico mostra un esempio di un secondo gate, che permette di ordinare i nuclei singolarmente scartando eventuali aggregati. Questo gate analizza le differenze nei tempi impiegati dai nuclei per attraversare il laser. Quelli che sono aggregati impiegano normalmente più tempo per passare attraverso di esso.

Questo parametro particolare è molto importante poiché l'inclusione di aggregati può interferire con la purezza, dato che alcuni nucleotidi fluorescenti potrebbero essere legati a quelli non fluorescenti. Infine, ecco dei dati tipici del terzo canale. Questo canale è impostato su una lunghezza d'onda di fluorescenza specifica, corrispondente a quella del fluorocromo presente nel nostro anticorpo secondario.

In questo grafico a fax, si osserva il livello di fluorescenza lungo l'asse x e un rilevatore a canale rosso profondo, PECY sette, lungo l'asse y. Questi dot blot offrono una rappresentazione visiva migliore rispetto a un singolo istogramma monocromatico. L'uso di SCADA consente di ordinare e separare nuclei neuronali nuovi e positivi da nuclei non neuronali nuovi e negativi.

Dopo aver selezionato tutti i parametri, i nuclei vengono ordinati in un unico XPBS. Una volta che l'intero campione è stato sottoposto al sorting, verificare la purezza dell'ordinamento analizzando un campione ordinato con Eloqua mediante lo strumento. Ecco un esempio di un risultato ottimale.

Confrontare qui il campione presort, che contiene una popolazione mista di nuclei, con l'Eloqua ordinato in cui sono stati eliminati la maggior parte dei nuclei negativi. Notare che le percentuali di purezza si basano sul numero di eventi che contaminano il campione in base ai gate impostati. Tenere presente che la prima volta che il campione viene analizzato attraverso la macchina, potrebbe verificarsi un certo sbiancamento, il che provoca un indebolimento del segnale; per tenere conto di ciò, potrebbero essere necessari alcuni aggiustamenti.

Dopo aver effettuato il sorting del campione, iniziare l'elaborazione dei nuclei. A tale scopo, prelevare 10 ml del campione ordinato e aggiungere 2 ml di soluzione di saccarosio, 50 microlitri di cloruro di calcio uno molare e 30 microlitri di acetato di magnesio uno molare. Se il volume del campione ordinato è inferiore a 10 ml, portare il volume a 10 ml aggiungendo un XPBS oppure regolare proporzionalmente i materiali aggiuntivi.

Successivamente, capovolgere il campione più volte e metterlo sul ghiaccio per 15 minuti. Trascorsi 15 minuti, centrifugare il campione in un rotore a cestello oscillante a 1.786 RCF per 15 minuti a quattro gradi. Al termine della centrifugazione, aspirare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet bianco presente sul fondo del tubo.

Quindi sciogliere il pellet in 200 microlitri della soluzione appropriata necessaria per gli esperimenti successivi. In questo caso, stiamo sciogliendo il pellet nel buffer di diluizione per l'esperimento successivo di chip. Quindi risospendere il pellet aspirando e dispensando ripetutamente con la pipetta.

A questo punto, è possibile trasferire i nuclei in una provetta più piccola e collocarla in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Fino a ulteriore utilizzo, beh, vi ho appena mostrato come isolare nuclei neuronali da tessuto cerebrale post mortem umano. Con questi nuclei, è possibile eseguire diverse analisi, come l'immunoprecipitazione della cromatina.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre i campioni sul ghiaccio poiché i nuclei sono non fissati e possono degradarsi a temperature elevate. Inoltre, è fondamentale manipolare i tessuti umani rispettando standard di sicurezza biologica di livello due o superiore. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.