Sezionamento automatizzato con vibratomo del tessuto polmonare incorporato nell'agarosio per l'imaging a fluorescenza multiplex
6 ottobre 2023
Abbiamo sviluppato una tecnica di processamento tissutale che utilizza un vibratomo e tessuto polmonare incorporato in agarosio per generare sezioni polmonari, consentendo così l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione dell'architettura polmonare. Abbiamo utilizzato la colorazione a immunofluorescenza per osservare l'espressione spaziale delle proteine utilizzando specifici marcatori strutturali polmonari.
Questo protocollo è particolarmente utile nei modelli animali di trapianto e rigenerazione polmonare di grandi dimensioni, come i maiali, dove possiamo campionare piccoli pezzi nel tempo. Questa tecnica può aiutarci a comprendere meglio la biologia spaziale in gioco in questi modelli. Questa tecnica produce fette di polmone minimamente processate adatte per l'imaging a immunofluorescenza senza la necessità di recupero dell'antigene ed è stata efficace con tutti gli anticorpi testati fino ad oggi.
Questa procedura può essere adattata per tagliare sezioni leggermente più spesse, diciamo intorno a un millimetro, che possono poi essere utilizzate nella microscopia a fluorescenza a foglio di luce per studiare l'espressione spaziale della proteina in un volume più tridimensionale. La nostra ricerca sta studiando i fattori che influenzano il rigetto del trapianto di polmone e sta sviluppando terapie per ridurre il rigetto utilizzando il nostro modello suino. Questa tecnica aiuta a comprendere i cambiamenti spaziali delle proteine che influenzano gli esiti del trapianto dopo l'intervento chirurgico.
Attualmente stiamo utilizzando questa tecnica per esplorare il panorama spaziale dell'espressione proteica nel nostro modello di trapianto di polmone suino. Speriamo che ci aiuti a comprendere meglio i meccanismi alla base delle nostre terapie sperimentali. La chiave per avere successo qui risiede negli avvistamenti di vibratomi, nelle alte ampiezze delle pale e nelle velocità di forza inferiori sono cose fondamentali da guardare se il sezionamento va male.
Panoramica
Questo studio presenta una nuova tecnica di elaborazione dei tessuti che utilizza un vibratomo e tessuto polmonare inclusi in agarosio per generare sezioni polmonari ad alta risoluzione. Il metodo consente la colorazione mediante immunofluorescenza per osservare l'espressione spaziale delle proteine nell'architettura polmonare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Trapianto polmonare
Sfondo
- Comprendere la biologia spaziale nei modelli polmonari è fondamentale per lo studio del trapianto polmonare.
- La tecnica produce fette di polmone minimamente elaborate, adatte all'analisi mediante imaging.
- Si è dimostrata efficace con diversi anticorpi senza richiedere il recupero dell'antigene.
- Adattabile a sezioni più spesse per tecniche di imaging avanzate.
Scopo dello studio
- Studiare i fattori che influenzano il rigetto del trapianto polmonare.
- Sviluppare terapie mirate a ridurre il rigetto nei trapianti polmonari.
- Analizzare l'espressione spaziale delle proteine in un modello di trapianto polmonare su suino.
Metodi Utilizzati
- Inclusione del tessuto polmonare in agarosio per il sezionamento.
- Utilizzo di un vibratomo per creare sezioni polmonari di spessore definito.
- Colorazione immunofluorescente per visualizzare l'espressione proteica.
- Analisi comparativa della distribuzione dei pneumociti di tipo due in campioni umani.
Risultati principali
- Generazione con successo di sezioni polmonari ad alta risoluzione.
- Identificazione di variazioni spaziali delle proteine che influenzano gli esiti del trapianto.
- Numero maggiore di pneumociti di tipo due e maggiore copertura dello scaffold nei campioni infantili rispetto a quelli adulti.
- Utilizzo efficace della tecnica su diversi campioni di tessuto polmonare.
Conclusioni
- La tecnica del vibratomo migliora la comprensione dell'architettura polmonare.
- Fornisce informazioni sull'espressione spaziale delle proteine, rilevante per la biologia del trapianto.
- Questo metodo potrebbe facilitare future ricerche nel campo del trapianto e della rigenerazione polmonare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La sezionatura automatizzata al vibratomo di tessuto polmonare incluso in agarosio consente di ottenere fette di polmone riproducibili e minimamente trattate, adatte all'immagine di fluorescenza multiplex attraverso diverse specie. Questo flusso di lavoro affronta la sfida del mantenimento dell'architettura polmonare nativa e dell'antigenicità, supportando analisi proteiche spaziali ad alto contenuto informativo, fondamentali per la ricerca traslazionale sul polmone. L'approccio migliora la fiducia predittiva nei modelli polmonari preclinici e fornisce indicazioni per studi meccanicistici su lesioni, rigenerazione ed esiti del trapianto.
Applicazioni strategiche nella ricerca e sviluppo biofarmaceutici
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dell'espressione spaziale delle proteine in tessuto polmonare nativo per la riduzione del rischio meccanicistica.
- Supporta la validazione funzionale del target preservando l'antigenicità senza necessità di recupero dell'antigene.
- Facilita studi comparativi su campioni di topo, suino e umani per una maggiore affidabilità del target interspecie.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce sezioni polmonari standardizzate e riproducibili, adatte a saggi di immunofluorescenza multiplex.
- Fornisce letture quantitative spaziali per la localizzazione e l'abbondanza delle proteine.
- Consente la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per la validazione e lo screening degli anticorpi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per le malattie, inclusi il trapianto polmonare e il danno in animali di grandi dimensioni.
- Supporta la scoperta di biomarcatori traslazionali consentendo una mappatura spaziale ad alta risoluzione delle variazioni proteiche.
- Facilita il progresso mirato alle terapie sperimentali attraverso un'analisi meccanicistica del rimodellamento tissutale e del rigetto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo integra le fasi iniziali della scoperta fino alla validazione preclinica, supportando i flussi di lavoro nella ricerca sul danno polmonare, sulla rigenerazione e sui trapianti.
- Biologia della scoperta: Permette di avanzare nella verifica di ipotesi sulla dinamica spaziale delle proteine nell'architettura polmonare integra.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per la valutazione di anticorpi e biomarcatori.
- Analisi: Consente il confronto statistico della distribuzione delle proteine e dell'abbondanza dei tipi cellulari in diverse condizioni e stadi di sviluppo.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati preclinici ottenuti nei modelli animali all'analisi dei tessuti umani per l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'elaborazione dei tessuti e l'imaging, adattabile a diversi programmi di ricerca polmonare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sui tessuti polmonari.
- Valore operativo: Standardizza l'elaborazione del tessuto e l'acquisizione delle immagini per garantire riproducibilità e scalabilità tra diversi progetti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo consentendo un'analisi spaziale robusta delle proteine in modelli traslazionali.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio di terapie mirate al polmone e di programmi di biomarcatori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso del vibratomo e nell'immagine di immunofluorescenza.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per vibratomo e microscopia a fluorescenza multiplex.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di sezionamento e colorazione per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a diversi modelli polmonari, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione in base allo spessore del tessuto e alla compatibilità degli anticorpi.
- I parametri di sezionamento e la manipolazione del tessuto devono essere controllati con attenzione per preservare la struttura nativa e l'antigenicità.
