Micro-Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è caratterizzare l'ambiente meccanico locale del parenchima polmonare a una scala spaziale rilevante per le cellule residenti, misurando direttamente le proprietà elastiche locali di tessuto polmonare fresco mediante microindentazione al microscopio a forza atomica. Questo viene ottenuto tagliando il tessuto polmonare di topo gonfiato con agarosio mediante lama di rasoio o bisturi, per preparare strisce di parenchima polmonare di cinque millimetri per cinque millimetri di lunghezza e larghezza, e di 400 micrometri di spessore. Successivamente, le strisce di tessuto polmonare non fissate e non permeabilizzate vengono sottoposte a immunomarcatura, che identifica le aree di interesse per la microindentazione al microscopio a forza atomica.

Successivamente, viene eseguita un'indentazione microscopica con FM su strisce di tessuto in PBS a temperatura ambiente. Per misurare direttamente le proprietà elastiche locali del tessuto polmonare fresco si ottengono risultati che mostrano differenze evidenti nell'intervallo e nella distribuzione della rigidità tissutale nei parenchimi polmonari normali e fibrotici, nonché ampie variazioni spaziali della rigidità, in particolare all'interno del campione polmonare fibrotico.

In base a mappe di rigidità estratte da curve di spostamento forzato ottenute mediante microindentazione con microscopio a forza atomica (FM). Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle misurazioni esistenti, come lo stiramento di strisce di tessuto, è che offre una risoluzione spaziale senza precedenti, fornendo una prospettiva unica sulle variazioni su scala microscopica della rigidità del tessuto. Questa misura può aiutare a rispondere a domande fondamentali, come in che modo la rigidità varia spazialmente all'interno del tessuto e quali siano l'entità e la scala spaziale delle variazioni di rigidità nella malattia.

Processi che portano al rimodellamento dei tessuti. Per preparare strisce di tessuto polmonare, iniziare stabilizzando la struttura del polmone per il taglio, gonfiando i polmoni isolati di topo. Per via intratracheale, con 50 millilitri per chilogrammo di peso corporeo di agarosio al 2% a basso punto di gel, preparato in PBS; legare l'organo alla trachea e raffreddare i polmoni gonfiati in un bagno di PBS a quattro gradi Celsius per 60 minuti. L'agarosio formerà un gel e si indurirà negli spazi aerei, stabilizzando delicatamente la struttura del polmone. Durante questo intervallo, utilizzando un rasoio o un bisturi, tagliare il tessuto polmonare di topo stabilizzato con agarosio in strisce di circa cinque per cinque millimetri di lunghezza e larghezza, e 400 micrometri di spessore.

Quindi lavare le strisce in PBS a 37 gradi Celsius per cinque minuti per rimuovere l'aros residuo ed escludere le vie aeree di grandi dimensioni e i vasi. Tagliare le strisce dalle regioni sottopleuriche distanti dai bronchi principali se si desidera visualizzare le vie aeree e i grossi vasi; tagliare le strisce dal tessuto polmonare più prossimale ai bronchi principali per isolare le aree di interesse per una microindentazione in FM. Visualizzare il tessuto mediante microscopia a contrasto di fase o immunomarcatura e osservare mediante microscopia a fluorescenza.

Consultare la parte scritta di questo protocollo per la procedura. Immediatamente prima di una caratterizzazione in microscopia a fluorescenza (FM), fissare le strisce di tessuto su coprioggetti da 15 millimetri rivestiti con poli-L-lisina sollevando il coprioggetto dal basso rispetto al tessuto in galleggiamento, assicurandosi che la striscia di tessuto si distribuisca uniformemente sulla superficie del coprioggetto. Se necessario, posizionare una seconda striscia pulita non rivestita sopra la striscia di tessuto e applicare una leggera pressione per favorire l'adesione del tessuto al coprioggetto rivestito con poli-L-lisina.

Calibrare il sistema AFM seguendo le istruzioni del produttore immediatamente prima di ogni serie di esperimenti di microindentazione. A tale scopo, determinare due parametri fondamentali: la costante elastica della mensola, utilizzando il metodo delle fluttuazioni termiche in aria, e la sensibilità di deflessione della mensola, che è un parametro utilizzato per convertire il segnale di uscita del fotodiodo nella reale distanza di deflessione della mensola.

Calibrare la sensibilità di deflessione ottenendo una curva standard di spostamento forzato in PBS su un vetrino pulito. Quindi calcolare la pendenza della curva di spostamento forzato nella misurazione della curva di spostamento forzato. La punta AFM viene avvicinata e allontanata dalla superficie del campione in un'unica posizione, monitorando la deflessione della mensola delta D in funzione dello spostamento della punta delta Z. Si raccomanda di utilizzare una mensola triangolare in nitruro di silicio con una punta sferica in borosilicato di cinque micrometri di diametro, impiegando sonde FM con una costante elastica di 0,06 newton al metro.

Abbiamo caratterizzato meccanicamente materiali morbidi con modulo di taglio compreso tra 100 e 50.000 pascal. Pulire la superficie inferiore del vetrino del campione con carta da laboratorio, quindi fissarlo a un normale vetrino in vetro con grasso da vuoto. Montare il vetrino in vetro sul portacampioni dell'AFM e ricoprire la carta con 500 microlitri di PBS a temperatura ambiente.

Quindi posizionare la testa di scansione FM sopra il campione. Regolare la piastra del campione del microscopio per impostare il microscopio sulla visione attraverso l'oculare, in modo da allineare la punta FM al centro del campo visivo. Spostare la piastra del campione FM per selezionare un'area di interesse sul tessuto.

Quindi passare alla visualizzazione con la telecamera CCD per registrare l'immagine in contrasto di fase e/o le immagini di fluorescenza del tessuto secondo necessità. Spostare lentamente la punta del microscopio a forza atomica (AFM) verso il basso finché non entra in contatto accurato con il campione. La caratterizzazione mediante microindentazione AFM di campioni morbidi richiede profondità di indentazione ridotte per evitare deformazioni locali elevate, che renderebbero non valido il modello di Hertz utilizzato per il calcolo del modulo elastico; per evitare grandi deformazioni, eseguire l'indentazione in modalità trigger impostando la deflessione massima della mensola a 500 nanometri.

Questo limite di deflessione limiterà la forza massima di indentazione a meno di 30 nanonewton. La velocità di indentazione deve essere scelta in modo da essere sufficientemente lenta da esplorare le proprietà elastiche piuttosto che quelle viscoelastiche del campione morbido. Selezionare un intervallo di velocità compreso tra due e 20 micrometri al secondo per il tessuto polmonare per una singola misurazione da un'area di interesse.

Spostare la sonda A FM nella posizione di interesse ed eseguire una singola indentazione per acquisire una curva forza-spostamento standard. La sonda si muoverà soltanto nella direzione Z. Per la mappatura automatica di una regione di interesse, passare alla modalità mappa di forza, selezionare le dimensioni della scansione e i punti di campionamento all'interno dell'area selezionata.

La punta AFM si sposta sulla superficie del campione tra un'indentazione e l'altra, raccogliendo singole curve forza-spostamento in ciascun punto di una griglia predeterminata. Abbiamo trovato pratico utilizzare una griglia di 16 per 16 punti per mappare un'area di 80 micrometri per 80 micrometri con una velocità di indentazione di 20 micrometri al secondo, operazione completabile in circa 10 minuti. Per calcolare il modulo di Young, si adatta la curva forza-spostamento al modello di indentazione sferica di Hertz mediante un fitting non lineare ai minimi quadrati, come mostrato qui, dove F è uguale a K con pedice C moltiplicato per delta D, ovvero la forza necessaria per flettere la mensola.

K sub C è la costante elastica della mensola. R è il raggio della sfera della punta, delta uguale a delta Z meno delta D è l'indentazione, e nu è il rapporto di Poisson del campione, che è pari a 0,4 per il tessuto polmonare. Per valutare la qualità dell'adattamento, calcolare il valore SSR, ovvero la somma dei quadrati delle differenze tra i dati e i valori stimati durante l'adattamento non lineare della curva.

Eliminare le misurazioni non affidabili o non interpretabili scartando i dati provenienti da curve difettose con valori elevati di SSR. Se necessario, convertire il modulo elastico o E in modulo di taglio G, utilizzando la relazione E uguale a due volte la somma di uno più nu per G. Per visualizzare i modelli spaziali di rigidità raccolti in modalità mappa di forza, tracciare i dati del modulo e le mappe di contorno, ad esempio, in una griglia 16 per 16 che copre un'area di 80 micrometri per 80 micrometri.

Per elaborare una grande quantità di dati di curve di forza, può essere scritto un algoritmo personalizzato per adattare automaticamente le curve forza-spostamento, estrarre moduli e/o tracciare mappe di contorno o innesti ELA. Utilizzando le stesse procedure e parametri appena descritti, questa figura mostra che il tessuto è stato correttamente tagliato e colorato. La microarchitettura alveolare del parenchima polmonare è ben preservata, come osservato mediante colorazione immunofluorescente per il componente della membrana basale, la laminina, senza fissazione né permeabilizzazione.

Questi pannelli mostrano la colorazione immunofluorescente per il collagene, eseguita su polmoni freschi non fissati ottenuti da topi precedentemente trattati con PBS o con bleomicina per indurre fibrosi. Qui vengono mostrati grafici di spostamento-forza ottenuti mediante microindentazione FM con la stessa forza applicata. La punta AFM genera una grande indentazione in una regione morbida, producendo una curva forza-spostamento relativamente piatta, mostrata in blu, rispetto a una piccola indentazione e a una curva forza-spostamento ripida in una regione più rigida, mostrata in rosso.

Per ottenere curve di forza pulite dopo ogni indentazione, la punta del microscopio a forza atomica (AFM) deve essere ritratta completamente dalla superficie del campione e libera da qualsiasi contatto prima della successiva indentazione. Questo stato senza contatto corrisponde alla regione piatta della curva, in cui la punta si sposta senza deflessione della mensola. Questa figura mostra una tipica curva errata priva di regione piatta, che si verifica quando la punta non viene ritratta completamente dalla superficie del campione, ad esempio quando un campione morbido aderisce alla punta, rendendo impossibile determinare il punto di contatto se la punta rimane completamente intrappolata nel campione morbido.

La curva può apparire di questo tipo, senza deflessioni chiare, ma con un lieve rumore. Questa figura mostra la rigidità. I dati estratti dalle curve di spostamento forzato sono visualizzati spazialmente come mappe di rigidità relative all'innesto di ELAs, in cui la scala cromatica corrisponde alla rigidità. Gli innesti di ELAs mostrano differenze evidenti nell'intervallo e nella distribuzione della rigidità del tessuto nel parenchima polmonare normale e fibrotico, nonché ampie variazioni spaziali della rigidità, in particolare all'interno del campione polmonare fibrotico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare l'ambiente meccanico locale del parenchima polmonare misurando direttamente le proprietà elastiche locali del tessuto polmonare fresco mediante microscopia a forza atomica.