Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Ciao, sono Amish Matan e lavoro nel laboratorio della dottoressa Sha Mc Barian, presso il dipartimento di psichiatria della UMass Medical School. Oggi vi mostrerò un procedimento per l'immunoprecipitazione della cromatina su tessuto cerebrale umano post mortem. Anche se il seguente procedimento non è particolarmente complesso.

Quello che è più entusiasmante è che fino a poco tempo fa gli studi sull'espressione nel cervello umano erano limitati a una semplice quantificazione di mRNA e proteine. Questa particolare tecnica ci fornirà una comprensione migliore della base meccanicistica dell'espressione genica sia nel cervello umano normale che in quello malato. Cominciamo dunque a immunoprecipitare la cromatina.

Abbiamo iniziato con tessuto cerebrale umano post mortem precedentemente dissezionato e congelato. È importante utilizzare occhiali di sicurezza e lavorare in un'area designata per la manipolazione di tessuti umani. Durante l'elaborazione di questi campioni, il tessuto cerebrale viene trattato con un volume di buffer per down sink pari a cinque volte il volume del cervello.

Una volta che tutti i tessuti sembrano essersi omogeneizzati nella soluzione, possiamo trasferirli in una provetta da due ml dopo l'omogeneizzazione del tessuto. Aggiungere cinque unità per ml di nucleasi micrococcale al campione e mescolare la soluzione aspirando e dispensando con una pipetta. Successivamente, porre il campione sul ghiaccio.

È importante eseguire rapidamente questo passaggio, poiché la micrococcale nuclease è in grado di agire anche a quattro gradi Celsius. Una volta che tutti i campioni sono stati trattati con micrococcale nuclease, passiamo rapidamente al bagnomaria a 37 °C e incubiamo i campioni per sette minuti.

Dopo l'incubazione di sette minuti, aggiungiamo EDTA 0,5 M a una concentrazione di 10 millimoli per arrestare l'attività della micrococcale nuclease. A questo punto siamo pronti per passare al passaggio di izzazione. Dopo il trattamento con micrococcale nuclease, i nostri campioni, che contengono il DNA nucleosomiale, inizieranno la izzazione.

Nava prenderà un tubo Falcon da 15 ml a cui aggiungeremo 4,5 ml di EDTA 0,2 millimolare, 2,5 microlitri di benadina 0,2 molare e 4,5 microlitri di PMSF 0,1 molare in questo tubo. Trasferiremo il nostro campione. Ora incubiamo il campione per un'ora sul ghiaccio, vorticosandolo ogni 10 minuti.

Al termine dell'incubazione di un'ora, aggiungeremo 2,5 microlitri di DTT tre molare. Il campione viene vortexato nuovamente, quindi centrifugato in un rotore a cestelli oscillanti a 3.175 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, il soprannatante viene distribuito in modo che 500 microlitri siano utilizzati come controllo di input, che conterrà soltanto DNA genomico, mentre il resto viene suddiviso in due provette contenenti ciascuna 1.600 microlitri di campione, che saranno i nostri campioni per l'immunoprecipitazione della cromatina.

Il controllo di input viene posto a meno 80 gradi Celsius durante la notte fino a ulteriore utilizzo. Successivamente, aggiungiamo 160 microlitri di 10 XFSB, pari a un decimo del volume del nostro campione. Insieme a questo, aggiungiamo quattro microgrammi dell'anticorpo.

Ora vortexare i campioni, quindi ruotarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, eseguiremo il lavaggio dei giros proteici che verranno utilizzati per isolare il nostro DNA nucleosomiale. Poiché queste perle di agarosio sono molto sensibili, è necessario tagliare le punte dei pipetti quando si lavora con loro.

Questo garantisce maggiore spazio per le perle durante la pipettaggio. Aggiungere ora 1,6 mil di una perla XFS a 245 microlitri di proteina jaguars in un tubo da centrifuga micro da due mil. Questa quantità dovrebbe essere sufficiente per quattro tubi di campione.

Successivamente, dividere la soluzione di perle in due provette da due mil e riempire ciascuna fino a 1,6 mil con un XFSB. Ruotare le provette a temperatura ambiente per 30 secondi su un agitatore rotante, quindi centrifugarle a 0,1 RCF per 30 secondi. Dopo la centrifugazione, rimuovere l'ATE utilizzando un vuoto.

Aggiungere 1,6 mils di un XFSB. Ruotare nuovamente i campioni per 30 secondi su un agitatore rotante e quindi centrifugarli di nuovo a 0,1 RCF FS per 30 secondi. Dopo la centrifugazione, rimuoviamo nuovamente il soprannatante e combiniamo entrambi i tubi con 1,5 mils di un XFSB.

Aggiungere anche 15 microlitri di DNA spermatico. Ruotare ora a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi centrifugare a 0,1 RCF per 30 secondi. Rimuovere il soprannatante e aggiungere 200 microlitri di FSB 1X.

Ora aggiungere 90 microlitri di agro speeds in ogni campione di precipitazione della cromatina, quindi ruotarli a quattro gradi per un'ora. Come controllo negativo, aggiungere un mil di 1 XFSB negli agro speeds rimanenti e ruotare insieme al campione di immunoprecipitazione della cromatina a quattro gradi Celsius per un'ora. Durante l'incubazione di un'ora, possiamo approfittarne per preparare un po' di buffer di risoluzione fresco.

Questo verrà utilizzato successivamente nell'esperimento dopo un'incubazione di un'ora. Centrifugare i campioni e il controllo negativo a 0,1 CFS per 30 secondi e scartare il soprannatante. Successivamente, si procederà al lavaggio delle perle con quattro diversi tipi di soluzioni di lavaggio: un buffer a bassa salinità, un buffer ad alta salinità, una soluzione di cloruro di litio e, infine, buffer TE a pH 8.

Per ogni tampone, eccetto la soluzione di cloruro di litio, ruotare i campioni per tre minuti a temperatura ambiente e quindi centrifugarli a 0,1 R Cs per 30 secondi. Per il lavaggio con cloruro di litio, ruotare i campioni a temperatura ambiente per soltanto un minuto. Dopo ogni lavaggio, eliminare il soprannatante mediante aspirazione con vuoto.

Ora siamo pronti per procedere all'eluzione dei nostri campioni. Per iniziare la fase di eluzione, aggiungiamo 250 microlitri di tampone eluuto appena preparato a ciascun campione. Ruotare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 0,4 RCF per un minuto.

Ora conservare il soprannatante in un tubo arancione da due ml. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di buffer di eluizione a ciascun campione. Ancora una volta, vortexare manualmente tutti per alcuni secondi.

Quindi, dopo aver vorticosato i campioni per 15 minuti, centrifugarli. Centrifugare i tubi a 16 RCF per quattro minuti e conservare il soprannatante nello stesso tubo da due millilitri. Per digerire le proteine nei nostri campioni, aggiungere prima 10 microlitri di A DTA 0,5 molar, 25 microlitri di twist HCL 0,8 molar a un pH di 6,5 e 2,5 microlitri di proteinasi K a 10 milligrammi per millilitro a ciascun campione di immunoprecipitazione della cromatina.

Accanto a ogni campione di controllo aggiungere 15 microlitri di buffer di lisi e 2,5 microlitri di proteasi K a 10 milligrammi per ml. Incubare entrambi i campioni di input e quelli di immunoprecipitazione della cromatina a 52 gradi Celsius per almeno tre ore. Ora che l'incubazione di tre ore è terminata, possiamo procedere con l'estrazione mediante fenolo-cloroformio.

Dopo l'incubazione di tre ore, aggiungiamo 500 microlitri di fenil cloroformiato a ciascun campione. Questa operazione viene eseguita nella cappa, poiché il fenil cloroformiato è un composto organico dannoso sia a contatto con la pelle sia se inalato. Successivamente, vortexiamo tutti i campioni per alcuni secondi e li centrifughiamo a 13 RCF per cinque minuti dopo la centrifugazione.

Dovrebbero essere presenti due fasi all'interno dei tubi. Poiché siamo interessati al contenuto della fase superiore, preleveremo la fase superiore e la trasferiremo in un tubo microcentrifugetto da due mil. Successivamente, a ciascun campione viene aggiunta una miscela composta da due microlitri di glicogeno e 50 microlitri di acetato di sodio tre molare, insieme a 1,375 mil di etanolo al cento per cento.

Tutti i campioni vengono vortexati vigorosamente e posti a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, i campioni vengono posti sul ghiaccio per scongelarli. Successivamente, vengono centrifugati ad alta velocità a 15 RCF per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet sul fondo della provetta. Successivamente, aggiungere un millilitro di etanolo freddo al 75% a ciascun campione e capovolgere le provette da quattro a sei volte. Le provette vengono quindi centrifugate nuovamente a 18 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Il soprannatante viene nuovamente rimosso e i pellet vengono lasciati asciugare all'aria. Una volta che i pellet sono asciutti, vengono disciolti in 50 microlitri di HCl traccia 4 millimolare a pH 8 e conservati a -80 gradi Celsius fino all'ulteriore utilizzo. Bene, vi ho appena mostrato come eseguire immunoprecipitazioni della cromatina su tessuto cerebrale post mortem umano congelato.

E ricordate, quando si esegue questa procedura, è importante adottare tutte le precauzioni necessarie quando si manipolano tessuti cerebrali umani; i saggi di immunoprecipitazione della cromatina possono essere utilizzati per aggiungere un ulteriore livello di comprensione dell'espressione genica sia nel cervello umano normale che in quello malato. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.