Analisi immunoblot

Il blotting immuno, spesso chiamato blotting occidentale (Western blotting), viene utilizzato per identificare, all'interno di un campione proteico, specifici antigeni riconosciuti da anticorpi policlonali o monoclonali. Questa procedura generalmente segue l'elettroforesi su gel unidimensionale o bidimensionale e prevede il trasferimento delle proteine separate su membrane di nitrocellulosa. L'incubazione di queste membrane con anticorpi primari e secondari, coniugati direttamente o indirettamente a enzimi, e la visualizzazione degli antigeni proteici su tali membrane mediante reazioni con substrati colorati o fluorescenti.

In questo video, forniamo una dimostrazione passo dopo passo di una procedura di immuno blotting. Salve, sono Sean Gallagher di UVPI che collabora con un centro proteomico presso l'Istituto Post-Laurea KE. Oggi vi mostrerò l'analisi mediante immuno blotting.

Il processo comprende diverse fasi, tra cui la separazione delle proteine, il trasferimento delle proteine su membrane, la rivelazione immunoistochimica e la visualizzazione mediante substrati cromogenici e chemiluminescenti. Cominciamo. Prima di iniziare la procedura di immunoblotting, i campioni proteici devono essere separati mediante elettroforesi utilizzando gel monodimensionali o bidimensionali di dimensioni ridotte o standard.

Preparare i campioni antigenici e caricarli nei pozzetti del gel, includendo proteine marcate con prestaining o biotinilate e standard di peso molecolare in uno o più pozzetti del gel. Questi marcatori proteici si trasferiranno sulla membrana e indicheranno in modo pratico l'orientamento della membrana e le dimensioni delle proteine dopo la colorazione immunoistochimica. Al termine dell'elettroforesi, siamo pronti ad assemblare il blot immunoistochimico.

Per assemblare il blot immuno, in primo luogo smontare il sandwich del gel e rimuovere il gel di accumulo. Equilibrare il gel per 30 minuti a temperatura ambiente nel buffer di trasferimento; questa equilibratura è necessaria per evitare variazioni nelle dimensioni del gel durante il trasferimento. Mentre il gel è in equilibratura, iniziare ad assemblare il sandwich di trasferimento in un vassoio sufficientemente grande da contenere la cassetta di trasferimento in plastica, riempito con buffer di trasferimento in modo che la cassetta sia completamente ricoperta. Posizionare ora un pad Scotch-Brite o una spugna sulla metà inferiore della cassetta di trasferimento in plastica.

Quindi prendere un foglio di carta da filtro ritagliato delle stesse dimensioni del gel. Inumidirlo con il buffer di trasferimento e posizionarlo sopra il tampone Scotch-Brite. Al termine dell'equilibratura del gel di 30 minuti, posizionare il gel sopra la carta da filtro.

Rimuovere eventuali bolle d'aria tra il gel e la carta filtrante passando delicatamente un tubo a saggio o una bacchetta di vetro sulla superficie del gel. In alternativa, è possibile utilizzare il rullo BioRad, fornito nel kit BioRad. Ricordarsi di indossare guanti quando si manipolano carte filtranti, gel e membrane.

L'olio delle mani bloccherà il trasferimento. Successivamente, preparare la membrana di trasferimento. Tagliare la membrana delle stesse dimensioni del gel, aggiungendo uno o due millimetri per ogni lato.

Quindi posizionare lentamente la membrana in acqua distillata con un bordo ad un angolo di 45 gradi; l'acqua risalirà per capillarità nella membrana e alla fine ne bagnerà l'intera superficie. Se viene inserita troppo rapidamente nell'acqua, l'aria rimarrà intrappolata e apparirà come macchie bianche sulla membrana. Le proteine non si trasferiranno su queste aree.

Una volta che la membrana è completamente bagnata, equilibrarla per 10-15 minuti nel buffer di trasferimento. Questa procedura di bagnatura è valida per membrane in nitrocellulosa e nylon. Solo le membrane in PVDF sono idrofobiche e non si bagnano semplicemente immergendole in acqua distillata o nel buffer di trasferimento.

Le membrane in PVDF devono essere immerse prima in metanolo al 100% per uno o due secondi, quindi equilibrate per 10-15 minuti nel buffer di trasferimento. Non permettere mai alla membrana di asciugarsi.

Se ciò si verifica, bagnare nuovamente con metanolo e quindi con il tampone di trasferimento. Una volta che la membrana è pronta, posizionare direttamente la membrana pre-bagnata sul lato superiore del gel. Ricordare di rimuovere tutte le bolle d'aria tra il gel e la membrana arrotolando delicatamente una provetta, una bacchetta di vetro o un rullo BioRad sulla superficie della membrana.

In seguito inumidire un altro pezzo di carta da filtro Watman da 3 mm. Quindi posizionarlo sopra la membrana ed eliminare nuovamente tutte le bolle d'aria. Successivamente, posizionare un altro tampone Scotch-Brite o una spugna sopra questa carta da filtro.

Completare il montaggio del sandwich per il blot immuno bloccando la metà superiore della cassetta di trasferimento in posizione. Ora che il sandwich per il blot immuno è stato assemblato, siamo pronti a trasferire le proteine dal gel alla membrana. Per iniziare la procedura di trasferimento, riempire il serbatoio dell'elettroblotter con tampone di trasferimento e inserire la cassetta di trasferimento contenente il sandwich nell'apparato di elettroblotting.

È importante posizionare il sandwich in modo che la membrana sia rivolta verso l'anodo o il lato positivamente carico del serbatoio. Collegare i cavi dell'alimentatore alle rispettive parti dell'apparato di elettrotrasferimento corrispondenti all'anodo e al catodo. Questo particolare apparato di trasferimento è dotato di un blocco refrigerante a base di ghiaccio.

Ora, trasferire elettroforeticamente le proteine dal gel alla membrana per 30-60 minuti a 50 volt con raffreddamento oppure per tutta la notte a 14 volt in una stanza fredda. Al termine del trasferimento, spegnere l'alimentatore e smontare l'apparato. Quindi rimuovere la membrana dall'apparato di trasferimento e segnare l'orientamento tagliando un angolo.

A questo punto, le membrane possono essere essiccate e conservate in un sacchetto di plastica richiudibile a quattro gradi Celsius per un anno. Prima di ulteriori elaborazioni, le membrane in PVDF essiccate devono essere immerse in una piccola quantità di metanolo al 100% per bagnare la membrana, quindi in acqua distillata per rimuovere il metanolo.

Dopo aver segnato l'orientamento, colorare il gel per verificare l'efficienza del trasferimento. Per visualizzare le proteine trasferite, è possibile colorare la membrana in modo reversibile con rubino cipro o in modo irreversibile con inchiostro indiano blu kamasi, blu nafthol o oro colloidale. Queste procedure di colorazione irreversibile non sono compatibili con membrane in nylon.

Ora che le proteine sono state trasferite sulla membrana, procedere con la rivelazione immunologica e la visualizzazione delle proteine. In questo passaggio, le proteine immobilizzate sulla membrana vengono sottoposte a sonda con anticorpi specifici per identificare e quantificare eventuali antigeni presenti. Per iniziare, posizionare la membrana in un vassoio di incubazione in plastica contenente 20 millilitri di buffer bloccante.

Alcune persone utilizzano sacchetti, ma spesso si preferiscono le vaschette poiché sono particolarmente utili quando si trattano numerosi frammenti in diverse soluzioni di anticorpo primario. Successivamente, incubare la membrana sigillata per 30-60 minuti a temperatura ambiente con agitazione su un agitatore orbitale o una piattaforma oscillante. Durante l'incubazione della membrana, diluire l'anticorpo primario nel buffer di blocco.

La diluizione è determinata empiricamente, ma è tipicamente compresa tra uno a 100 e uno a 1000. Per un anticorpo policlonale, da uno a 10 a uno a 100 per supernatanti di ibridoma e superiore a uno a 1000 per liquidi acidi murini contenenti anticorpi monoclonali. Al termine dell'incubazione, versare via il buffer bloccante.

Sostituire il tampone con l'anticorpo primario diluito e quindi incubare nuovamente per 30-60 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante. Successivamente, lavare la membrana quattro volte agitando con 100 millilitri di TTBS per filtri in NITROCELLULOSA o PVDF oppure TBS per filtri in nylon.

Sciacquare per 10-15 minuti ogni volta; mentre la membrana viene lavata, diluire l'anticorpo secondario nel buffer di blocco. Esempi di anticorpi secondari includono perossidasi del rafano, fosfatasi alcalina, coniugati anti-Ig, enzimi coniugati disponibili in commercio. Gli anticorpi secondari vengono solitamente diluiti da 1:200 a 1:25.000 prima dell'uso.

Dopo aver completato i passaggi di lavaggio e aver scartato i materiali, aggiungere il coniugato di perossidasi di ravanello o fosfatasi alcalina anti-Ig diluito e incubare da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante. Trascorsi da 30 a 60 minuti, rimuovere la membrana dal contenitore e lavarla quattro volte, per 10-15 minuti ciascuna volta, in TTBS come descritto in precedenza.

Una volta completati i lavaggi, siamo pronti per passare alla fase di visualizzazione. Ma prima, illustreremo una procedura alternativa di immunorilevamento. Questa procedura alternativa di immunorilevamento si basa sul kit di colorazione A BC di Vector Labs.

Utilizza un complesso avidina-biotina per legare la perossidasi del rafano o HRPO o la fosfatasi alcalina AAP all'anticorpo secondario biotinilato. Oggi illustreremo il kit HRPO. Il TTBS è particolarmente adatto come buffer di blocco per i sistemi avidina-biotina.

Tuttavia, per i filtri in nylon, si raccomandano reagenti di legame proteico poiché il latte scremato in polvere contiene biotina residua, che interferirebbe con il saggio immunoistochimico. Deve essere utilizzato esclusivamente nel passaggio di blocco, iniziando a equilibrare la membrana nel buffer di blocco in una vaschetta aperta con agitazione costante mediante agitatore orbitale o piattaforma oscillante. Incubare la membrana da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente mentre la membrana raggiunge l'equilibrio.

Preparare la soluzione dell'anticorpo primario. Utilizzare TTBS per membrane in NITROCELLULOSA o PVDF con sistemi Aden. Biotina ad alta sensibilità.

Il diluizione della soluzione contenente l'anticorpo primario varia generalmente da 1:1000 a 1:100.000. L'uso della chimica chemiluminescente richiede gamme di diluizione più elevate. Nel nostro caso, si dimostra la rivelazione cromogenica.

Stiamo utilizzando una diluizione 1:5.000 dell'anticorpo primario. Una volta completata l'equilibratura, rimuovere il buffer di blocco. Quindi aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di anticorpo primario per coprire completamente la membrana.

Incubare la membrana per 30 minuti a temperatura ambiente con movimento dolce a dondolo dopo 30 minuti. Lavare la membrana tre volte in TTBS per nitrocellulosa a intervalli di cinque minuti. Durante il passaggio di lavaggio, preparare la soluzione dell'anticorpo secondario biotinilato diluendo una goccia di anticorpo biotinilato con 10 millilitri di TTBS. Al termine dei passaggi di lavaggio, aggiungere la soluzione dell'anticorpo secondario.

Incubare la membrana per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione lenta mentre viene incubata con l'anticorpo secondario. Preparare l'avadon biotina HRPO per eseguire questa procedura. Mescolare due gocce del reagente A del colorante vti e due gocce del reagente B in 10 millilitri.

TTBS per nitrocellulosa. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al termine dell'incubazione con l'anticorpo secondario. Lavare la membrana tre volte nell'arco di 15 minuti con TTBS o TBS.

Successivamente, aggiungere la soluzione enzimatica avidina-biotina alla membrana e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione lenta. Quindi lavare la membrana tre volte a intervalli di 10 minuti con TTBS. Ora che la procedura di immunorilevamento è completata, le proteine legate alla membrana sono pronte per essere visualizzate mediante substrati cromogenici.

Per questo passaggio finale di visualizzazione, i substrati CN-DAB/ICL2 e TMB sono comunemente utilizzati con procedure di immunorilevamento basate sulla perossidasi del rafano. Se il lavaggio finale della membrana durante la procedura di sonda immunitaria è stato eseguito in TTBS, lavare la membrana per 15 minuti a temperatura ambiente con 50 millilitri di TBS. Posizionare ora la membrana nella soluzione cromogenica per la visualizzazione.

Le bande proteiche dovrebbero apparire tra 10 e 30 minuti. Dopo l'incubazione di 30 minuti, scartare la miscela di reazione del substrato e terminare la reazione aggiungendo acqua distillata. Il blotting immuno è una procedura articolata in più passaggi utilizzata da migliaia di laboratori per rilevare la presenza di proteine specifiche dopo elettroforesi mono- o bidimensionale.

Vi ho appena mostrato come eseguire un'analisi del sangue immunologica. Questo è tutto. Buona fortuna con i vostri esperimenti e grazie per averci seguito.