Multiplex fluorimetrico Metodologia di test immunoenzimatico e risoluzione dei problemi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare anticorpi contro agenti infettivi avventizi negli animali da laboratorio. Questo viene ottenuto incubando il siero in esame con microsfere rivestite di antigene. Successivamente, il siero viene incubato con un'immunoglobulina anti-specie specifica marcati con biotina, che rileva eventuali complessi immunitari antigene-anticorpo.

Quindi viene aggiunta una soluzione di streptavidina marcata con FICO eryn Fluor force per rilevare eventuali immunoglobuline biotinilate; i risultati ottenuti mostrano lo stato anticorpale positivo o negativo per agenti comuni nei roditori da laboratorio, in base al punteggio netto dell'immunoassay a fluorescenza multiplex, ai valori fluorescenti del campione. Il principale vantaggio dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come Eliza è che MFIA è un saggio multiplex. Ciò consente a un ricercatore di analizzare fino a cento diversi saggi in un singolo test.

Beh, questa tecnica riduce la quantità di sieri e di materiali monouso smaltiti rispetto ai metodi esistenti, aumentando al contempo la quantità di informazioni ottenute da un singolo test. Inizialmente abbiamo avuto l'idea di utilizzare questo metodo quando stavamo analizzando un elevato numero di campioni di siero per diversi agenti e desideravamo ridurre lo sforzo lavorativo e il tempo di analisi. A dimostrare la procedura sarà Donna Cohen, tecnologa senior del nostro laboratorio. Per cominciare, preparare due tamponi necessari per la procedura di immunodosaggio fluorescente multiplo o MFIA.

Il primo è un diluente primario, disponibile presso Charles River, che contiene agenti bloccanti proprietari per ridurre le interazioni non specifiche nel buffer di lavaggio per il saggio. Preparare una soluzione di PBS con BSA al 1% a pH 7,4 per rimuovere le particelle. Filtrare il buffer attraverso un'unità sterile da bottiglia da 0,2 micron in contenitori sterili etichettati utilizzando il buffer di lavaggio per il saggio.

Preparare due concentrazioni x di specie antis biotinilata, IGG o BAG e streptavidina e ficocianina o SPE, che verranno utilizzate per etichettare i complessi antigene-anticorpo formati durante il passaggio di incubazione con siero di prova, per preparare campioni dei seguenti materiali e dispositivi monouso: micropipette multicanale e monocanale con relative punte, e piastre microtitolazione da 96 pozzetti a bassa adesione proteica per la diluizione delle proteine. Dopo aver raccolto i campioni di sangue e isolato il siero, vortexare brevemente il siero prima di diluire i campioni nel diluente primario in una piastra microtitolazione da 96 pozzetti per garantire un'adeguata e uniforme evacuazione dei pozzetti; prerisciacquare ogni pozzetto della piastra da 96 pozzetti con tampone di lavaggio per saggio, quindi aspirare lentamente la soluzione durante tutto il saggio.

L'aspirazione deve richiedere da cinque a dieci secondi per evitare l'aggregazione delle microsfere e il loro compattamento nella membrana filtrante, entrambi i fenomeni possono rallentare i tempi di lettura al termine del saggio. Verificare che lo scarico del liquido si sia arrestato tamponando la parte inferiore della piastra di prova con tovaglioli di carta. È importante tamponare la piastra di prova dopo ogni passaggio di lavaggio per prevenire il fenomeno di risalita del liquido dai pozzetti durante l'incubazione.

Per preparare le perle, iniziare agitando la sospensione di perle coniugate in stock mediante vortex. Successivamente, sottoporle brevemente a sonificazione in bagno. È fondamentale risospendere correttamente le perle per evitare la formazione di aggregati, che potrebbero causare tempi di lettura più lunghi.

Successivamente, distribuire la sospensione del ceppo 20 x in una soluzione di perle a concentrazione lavorativa 2 x nel diluente primario. Quindi distribuire 50 microlitri della sospensione di perle 2 x in ciascun pozzetto dell'analisi della piastra di prova pre-umidificata. Pipettare 50 microlitri di ciascun siero di prova e controllo 2 x nella piastra di prova in base a una mappa della piastra predeterminata.

Fissare il coperchio alla piastra. Coprirla con della carta d'alluminio e incubare la piastra di prova per 60 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per evitare l'evaporazione delle soluzioni, che potrebbe compromettere il successo del saggio. Mantenere la piastra di prova coperta con il coperchio della piastra durante tutti i passaggi di incubazione.

Inoltre, l'agitazione deve avvenire a una velocità superiore a 400 ma inferiore a 700 giri al minuto, in modo che le microsfere rimangano in sospensione, permettendo agli anticorpi sierici di accedere a tutte le superfici degli antigeni legati. Dopo aver lavato la piastra mediante incubazioni sequenziali delle microsfere con BAG e SPE, lavare nuovamente i campioni. Successivamente, risospendere le microsfere aggiungendo 125 microlitri di tampone di lavaggio per il saggio e agitare per due minuti prima di leggere la piastra.

Posizionarlo nel lettore del saggio entro 10 minuti dalla risospensione delle microsfere; le microsfere passano una alla volta attraverso un rilevatore in cui vengono esposte a due laser. Un laser eccita i coloranti interni che identificano il set cromatico delle microsfere e l'altro eccita il colorante reporter FICO erything. L'intensità della fluorescenza FICO erything per un numero predeterminato di microsfere viene riportata come valore FM FI; leggere il primo pozzetto per verificare che il pannello di microsfere selezionato corrisponda al profilo delle microsfere nei pozzetti del test.

Se ci sono perle che cadono al di fuori della loro regione designata nel display del protocollo, è stata effettuata una selezione del profilo errata. Le perle che sono state correttamente risospese riempiranno le loro regioni specificate come indicato nel software del lettore per saggi. Se le perle sono aggregate, riempiranno le loro regioni a un ritmo lento.

È possibile rimuovere la piastra di prova dal lettore e risospendere manualmente i pozzetti per separare le perle. Rimuovere la piastra di prova dal lettore e, utilizzando una pipetta multicanale, aspirare e dispensare ogni pozzetto da tre a quattro volte. Quindi reinserire la piastra di prova nel lettore e continuare a esaminare i risultati.

Segnalare eventuali errori, come conteggi inadeguati di perle o punteggi delle perle IgG anti IgG inferiori alla soglia, e ripetere il saggio per questi campioni. Dopo aver esportato i dati in Excel e calcolato il MFI netto, determinare se uno dei controlli del saggio di prova risulti fuori dai limiti, escludendo il siero immune ad alto range. Eventuali controlli non validi sono inaccettabili e il saggio deve essere ripetuto.

Questa tabella rappresenta i dati relativi al siero in prova e ai controlli del saggio provenienti da una piastra tipica. Tutti i controlli IgG hanno superato il test. I risultati per questa piastra indicano che numerosi campioni di controllo reattivi ai tessuti e IgG non hanno superato il test, come mostrato nelle pozzette arancioni.

A1C uno e F1 indicano un fallimento reattivo del tessuto TC in cui il punteggio TC è riportato tra parentesi; i pozzetti B uno ed E uno illustrano i due tipi di fallimento del controllo interno IgG, rispettivamente anticorpo del test insufficiente o reagenti del test insufficienti, BAG o SPE. I risultati della piastra del test vengono interpretati solo se il controllo di idoneità del sistema e il controllo sierologico soddisfano i criteri di accettazione qui indicati. Le microsfere rivestite con immunoglobuline anti siero del test specifiche per specie possono mostrare punteggi non conformi a causa dell'aggiunta di un campione insufficiente, di una diluizione del campione troppo elevata, di una specie errata o del siero prelevato da un ospite immunodeficiente.

Se i risultati del controllo del saggio sul gioco di prova sono soddisfacenti, i punteggi individuali del saggio vengono classificati secondo quanto segue. Seguendo questa procedura, dovremmo utilizzare metodi aggiuntivi come Eliza, IFA e/o Western blot per confermare i risultati iniziali inattesi o positivi. È fondamentale verificare questi risultati prima di prendere qualsiasi decisione relativa alla gestione degli animali.

Questo può essere eseguito utilizzando diverse metodologie sullo stesso campione o su campioni aggiuntivi provenienti dalla stessa colonia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il saggio immunoanalitico multiplex con marcatura fluorescente e di come interpretare i risultati ottenuti presso la tua struttura. Ciò ti permetterà di ridurre la manodopera pur raccogliendo maggiori informazioni da ciascun pozzetto del campione in esame.