Generazione di cellule derivate dal midollo osseo dendritiche murini per l'uso in 2-fotone Imaging

La preparazione di cellule dendritiche da midollo osseo fornisce un'ottima fonte di cellule presentanti l'antigene che possono essere utilizzate per esperimenti in vitro o in vivo nell'ambito dell'immagineggiamento in tempo reale del sistema immunitario. L'introduzione di cellule presentanti l'antigene consente lo studio delle interazioni specifiche tra cellule in risposta all'antigene nel contesto del linfonodo vivente. Qui illustriamo l'isolamento sterile del midollo osseo e le tecniche di coltura per la produzione di cellule dendritiche mature.

Inoltre, seguiamo lo sviluppo delle cellule dendritiche dal giorno uno al giorno 11. Questo sviluppo è rappresentato mediante immagini fisse e video realizzati all'interno dell'incubatore utilizzando la tecnologia scent incus site. Infine, mostriamo cellule dendritiche derivate dal midollo osseo che presentano l'antigene cove a cellule T OT due nel linfonodo specchio.

Ciao, sono Melanie Matthew nel laboratorio di Micah Halen presso l'Università della California vicina. Ti sei mai chiesto cosa succede all'interno del bioreattore mentre le tue cellule crescono? Oggi?

Come parte del nostro protocollo, vi mostreremo come utilizzare alcuni strumenti in situ. Il dispositivo in situ consente di monitorare la crescita delle colture cellulari all'interno dell'incubatrice. In questo protocollo, vi mostreremo come isolare e preparare cellule derivate dal midollo osseo da topo.

La prima cosa che vi mostrerò come fare è rimuovere le ossa del femore ed isolare il midollo osseo. Prima di tutto, fissate l'animale. Successivamente, inumidite l'animale con etanolo al 70%. Praticate la prima incisione lungo la linea mediana dell'animale.

Quindi effettuate un taglio all'interno della gamba, come vi sto mostrando qui. Per esporre il tessuto muscolare sopra il femore, dovreste essere in grado di spostare il muscolo da parte e afferrare l'osso grande del femore con le pinzette da dissezione. Mentre tenete l'osso con le pinzette da dissezione, spostatevi lungo l'osso ed effettuate il primo taglio appena al di sotto dell'articolazione.

Quindi spostate le forbici lungo la lunghezza del femore e tagliate il più vicino possibile al corpo. Ciò potrebbe causare una piccola quantità di sangue, specialmente se si recide l'arteria femorale. Quando si rimuove il femore, è estremamente importante che l'osso venga mantenuto integro.

Come puoi vedere, le estremità dell'osso non sono state tagliate né danneggiate. Una volta rimosso il femore, rimuovi qualsiasi tessuto aggiuntivo e posiziona il femore in una piccola capsula contenente il nostro mezzo PMI. Quando rimuovi il tessuto aggiuntivo, assicurati che l'osso del femore non si secchi.

A questo punto, le ossa del femore devono essere trasferite in una piastra contenente etanolo al 70% e poste sul ghiaccio per cinque-dieci minuti. Ai fini di questo video, proseguiremo sul banco del laboratorio. Tuttavia, in questa fase dell'esperimento, tutto dovrebbe essere trasferito all'interno di una cappa a flusso laminare per colture cellulari.

Dopo aver lasciato le ossa in ammollo nell'etanolo, è possibile trasferirle in una piastra più grande contenente mezzo sterile per l'asportazione del midollo osseo. Ora siamo pronti per rimuovere e risospendere il midollo osseo. Riempire una siringa per insulina con mezzo sterile e metterla da parte per un uso successivo.

Afferrare l'osso con pinzette sterili. Tenerlo sopra una piccola piastra per i pezzi da scartare e tagliare le epifisi o le estremità dell'osso da entrambi i lati. Inserire la siringa per insulina da un lato dell'osso ed espellere il midollo dall'osso in 15 ml di mezzo di coltura.

Lavare l'osso altre una o due volte finché tutto il midollo non è stato eliminato. Una volta rimosso il midollo dall'osso, quest'ultimo sarà quasi completamente bianco. Posizionare l'osso pulito nel contenitore per i rifiuti e ripetere il procedimento con l'altro femore.

Una volta completata questa fase, rimuovere delicatamente eventuali frammenti di midollo non disgregati durante il lavaggio, al fine di ottenere una sospensione monocellulare. Questa operazione richiederà da cinque a dieci minuti di pipettaggio. Trasferire la sospensione monocellulare in una provetta conica da 50 ml e lavare la piastra almeno tre volte con 10 ml di mezzo.

Ogni volta, centrifugare le cellule, rimuovere il mezzo e risospendere le cellule premendo con decisione e rapidità le dita contro il fondo del tubo. Per rimuovere i globuli rossi o eritrociti, si esegue una lisi con acqua. Un altro metodo per l'eliminazione dei globuli rossi è la lisi con cloruro di ammonio.

Entrambi i metodi sono stati descritti in precedenti articoli video di JoVE. Isolamento di cellule T CD4 positive da linfonodi di mouse utilizzando il sistema di purificazione Milan max, numero di JoVE 9, e la preparazione del fattore di crescita delle cellule T da citociti di ratto, JoVE numero 10.

Dopo la rimozione dei globuli rossi, siete ora pronti per essere coltivati. Prima di illustrarvi la coltura di cellule dendritiche, vorrei presentarvi il sito incus. Il sito incus permetterà di monitorare la crescita delle colture cellulari all'interno dell'incubatrice, in modo da poter osservare il nostro comportamento o eventuali anomalie.

Una volta preparata la coltura, la si posiziona nel vassoio di dimensioni adeguate e si chiude lo sportello del sito incus. Successivamente, sul proprio computer, si imposta semplicemente l'intervallo di tempo, si scelgono le pozzette da immaginare e si lascia che il sito inky raccolga i dati autonomamente. I filmati mostrati in questo protocollo illustrano le variazioni della morfologia delle cellule dendritiche in vitro.

Questi video sono stati esportati direttamente dal programma del sito Incus. Mentre le cellule dendritiche si sviluppano dal primo al giorno 11, è possibile osservare un effettivo cambiamento morfologico mentre aumentano di dimensioni e assumono il fenotipo delle cellule dendritiche. Dopo la lisi dei globuli rossi e la loro rimozione, le cellule vengono lavate nel mezzo primario per cellule dendritiche e seminate a 5 milioni per ml.

Queste cellule devono essere inizialmente coltivate in un mezzo di coltura per cellule dendritiche primarie e successivamente in un mezzo secondario per cellule dendritiche, integrato con 40 nanogrammi per ml di IL-4 e 100 nanogrammi per ml di TNF-α. Queste citochine favoriranno lo sviluppo di cellule dendritiche mature che assomigliano a cellule dendritiche derivate da monociti. Ora vi mostrerò l'aspetto delle colture durante il loro sviluppo e come mantenerle nel tempo.

Dopo aver seminato le cellule, è possibile coltivare le cellule dendritiche per 72 ore prima del primo cambio di mezzo. Ecco come apparirà tipicamente la coltura subito dopo il seeding delle cellule al primo giorno. E questo è l'aspetto delle cellule.

Al terzo giorno, si può osservare che le cellule hanno iniziato ad aderire alla piastra ma non hanno ancora assunto il fenotipo classico delle cellule dendritiche. Al quarto giorno, rimuovere il mezzo e aggiungere 10 ml di mezzo fresco per colture primarie di cellule dendritiche, aspirando il mezzo. Al quarto giorno, rimuoveremo i linfociti e qualsiasi altra cellula non aderente.

Ora potete riposizionare le piastre nell'incubatore per altri tre giorni, sette giorni dopo la semina iniziale. Ecco come apparirà la vostra coltura tipica. Potete notare che è il momento di suddividere le cellule e ripiarle.

Al settimo giorno, le cellule dendritiche vengono rimosse dalla piastra aspirando il mezzo e quindi aggiungendo EDTA sterile 300 millimolare, lasciando incubare per cinque minuti. Successivamente, la piastra viene ripetutamente risciacquata tenendola ad un angolo di 45 gradi e pipettando la soluzione di EDTA contro il retro della piastra. Questa operazione viene eseguita per diversi minuti per assicurarsi di rimuovere tutte le cellule dendritiche aderenti.

Le cellule vengono raccolte in un tubo conico da 50 milli e lavate due volte con mezzo secondario per DC. Le cellule vengono quindi risospese e seminate a 5 milioni di cellule per piastra. Le cellule dendritiche del giorno sette appena rimesse in coltura si depositano rapidamente sul fondo della piastra, aderiscono e iniziano a espandersi.

Come si può vedere nel video del sito Zichy, questo video è stato registrato nell'incubatrice nell'arco di due giorni per mostrarvi lo sviluppo delle cellule dendritiche, dalla reimpiantazione iniziale effettuata al giorno sette fino all'inizio del giorno nove. Le cellule dendritiche morfologiche possono essere attivate mediante stimolazione con antigene aggiungendo due microgrammi per mL di LPS insieme a cento microgrammi di ova, da utilizzare con linfociti T purificati da topi OT2, che possiedono linfociti T CD4 positivi specifici per l'ova. Se si utilizza un antigene diverso, è importante assicurarsi di usare una concentrazione ottimale di antigene per la stimolazione delle cellule dendritiche. Qui, l'ova e il LPS vengono aggiunti al mezzo primario in modo che la concentrazione finale di LPS sia di due microgrammi per mL in 20 mL e quella di ova sia di cento microgrammi per mL in 20 mL.

Ecco una fotografia di come appare un tipico coltura di cellule dendritiche al giorno 10. In questa immagine si può notare che la morfologia è molto tipica di una cellula presentante l'antigene. È sempre necessario verificare la percentuale di cellule dendritiche positive per CD11c mediante FACS.

Questo passaggio garantisce di ottenere una coltura relativamente pura di cellule dendritiche da utilizzare nei propri esperimenti. Qui utilizziamo il sistema Inky Site di SEN Instruments per monitorare l'attivazione delle cellule dendritiche trattate con LPS e sottoposte a pulsazione con antigene al giorno 10. Questo video copre un periodo di 24 ore immediatamente successivo all'aggiunta di LPS, del val e del peptide; durante questo intervallo, le cellule dendritiche diventano più attive e si osservano alcuni evidenti cambiamenti morfologici.

Dopo aver attivato le cellule dendritiche nel pulsante di antigene, potete nuovamente raccoglierle mediante incubazione con EDTA 300 millimolare e lavaggio della piastra. Adesso centrifugate le cellule, lavatele due volte con 50 ml di mezzo RPMI per rimuovere qualsiasi antigene residuo ed etichettatele con il colorante tracker cellulare appropriato. In questo esperimento, immaggerò le cellule nel linfonodo inguinale.

Dovremo iniettare da due a 5 milioni di cellule dendritiche per via dermica nella regione del fianco del topo mostrato qui. Successivamente, lasceremo trascorrere 24 ore affinché le cellule dendritiche raggiungano il linfonodo di destinazione. In questo video, le cellule dendritiche sono marcate con CMF due hc, un colorante blu per il tracciamento cellulare.

È possibile osservare le cellule dendritiche che interagiscono con linfociti T marcati specifici per l'antigene volin. Questi linfociti T sono marcati con ccf SE. È inoltre possibile utilizzare C-M-T-M-R o uno qualsiasi degli altri coloranti traccianti cellulari come sonde molecolari. Questa è la fase iniziale di attivazione dei linfociti T che interagiscono con le cellule dendritiche.

Poiché sono specifici per l'antigene, si può osservare che le cellule T aderiscono ai prolungamenti delle cellule dendritiche marcate in blu. Questo conclude il nostro protocollo che illustra la preparazione e l'uso di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo di topo in un esperimento di imaging a due fotoni. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.