Contrasto di fase e interferenza differenziale contrasto (DIC) Microscopia
6 agosto 2008
Questo protocollo mette in evidenza i principi e le applicazioni pratiche di fase e contrasto interferenziale differenziale (DIC) Microscopia
La microscopia ottica è uno degli strumenti più importanti, se non il più importante, nel campo della ricerca biomedica. A seconda dell'applicazione, sono desiderabili diversi modi di illuminazione per l'osservazione del campione. Questo video illustrerà due modalità ottiche di illuminazione a luce trasmessa: contrasto di fase e microscopia a contrasto di interferenza differenziale, o DIC.
Ciao, sono Victoria San Frolic della struttura centrale di Imaging Ottico presso il Centro per le Scienze della Salute dell'Università del Texas a San Antonio. Oggi vi mostrerò come osservare correttamente i campioni utilizzando la microscopia a contrasto di fase e a contrasto di interferenza differenziale. Cominciamo dunque.
La microscopia in campo chiaro standard non è adeguata per visualizzare campioni trasparenti e incolori. La microscopia a contrasto di fase è spesso utilizzata per generare contrasto in campioni biologici trasparenti e non assorbenti alla luce. La tecnica fu scoperta da Zurich nel 1942, il quale ricevette il Premio Nobel per il suo risultato.
Il microscopio a contrasto di fase è un microscopio ottico a campo chiaro dotato di speciali obiettivi a contrasto di fase, che contengono una piastra o anello di fase, e di un condensatore anulare al posto di un diaframma. L'anello si trova generalmente nella torretta del condensatore e la sua dimensione deve essere selezionata in base agli obiettivi utilizzati. Dopo aver impostato l'illuminazione Köhler, scegliere l'obiettivo a contrasto di fase appropriato e quindi ruotare l'anello di fase corrispondente nella posizione corretta all'interno del condensatore.
Dopo aver allineato correttamente l'anello di fase dell'obiettivo e l'annulus del condensatore in modo che siano concentrici e sovrapposti, possiamo osservare il campione e regolare adeguatamente la messa a fuoco. Vediamo ora come appare il contrasto di fase attraverso il microscopio. Ecco un'immagine di una sezione di fegato di ratto.
In contrasto di fase. Questo metodo migliora l'aspetto del materiale biologico modificando il contrasto da diverse sfumature di grigio a sfumature che vanno dal nero al bianco. Tuttavia, si noterà che i campioni sono circondati da un alone, che oscura le strutture fini.
Questo alone è un artefatto derivante dall'illuminazione mediante l'anello di fase. Ora noterà che, passando al campo chiaro, questo campione risulta molto difficile da osservare. Tornando al contrasto di fase, possiamo vedere chiaramente la struttura e la forma delle cellule nel tessuto epatico del ratto. Fin dalla sua introduzione alla fine degli anni '60.
La microscopia a contrasto di interferenza differenziale, o DIC, è stata molto utilizzata nella ricerca biomedica perché produce immagini ad alta risoluzione di strutture fini, aumentando il contrasto delle interfacce; l'immagine ottenuta corrisponde a una sezione ottica molto sottile. In effetti, la capacità della DIC di produrre sezioni ottiche l'ha resa una modalità utile di illuminazione a luce trasmessa anche per la microscopia confocale. Il microscopio DIC è un microscopio ottico a campo chiaro a cui sono stati aggiunti i seguenti elementi: un polarizzatore posizionato tra la sorgente luminosa e il condensatore.
Un prisma divisore del fascio DIC nel condensatore, un prisma combina fasci DIC subito dietro l'obiettivo e un analizzatore nello spazio all'infinito prima dei due oculari. Per ottenere le migliori prestazioni dall'ottica DIC, è importante innanzitutto allineare il microscopio per l'illuminazione di Köhler e quindi inserire gli elementi DIC nel percorso ottico. La luce proveniente dalla sorgente attraversa un polarizzatore e viene quindi divisa dal primo prisma.
Questi fasci accoppiati viaggiano vicini l'uno all'altro. Se la coppia attraversa lo stesso materiale nel campione, quando vengono ricombinati dal secondo prisma non interferiscono tra loro e appaiono quindi grigi. Tuttavia, sul bordo di una struttura, uno dei due fasci dell'accoppiamento attraversa un materiale diverso rispetto al suo compagno e viene modificato.
Quando questi fasci vengono ricombinati dal secondo prisma, interferiranno in modo costruttivo producendo un punto luminoso oppure in modo distruttivo producendo un punto scuro. Ecco un'immagine di diatomee in contrasto DIC. Si noterà che i dettagli fini della struttura delle diatomee sono chiaramente visibili.
Tuttavia, se si rimuovono le ottiche DIC, questi dettagli scompaiono. Il contrasto attraverso il campione è chiaro da un lato e più scuro dall'altro. Questo dà l'impressione di una topografia, ma in realtà si tratta di un'illusione.
La direzione dell'effetto di ombra proiettata può essere invertita ruotando il polarizzatore attraverso un punto di incrocio fino al contrasto opposto. Abbiamo appena esaminato le modalità ottiche del contrasto di fase e del DIC. Per ricordarvi, l'eliminazione del contrasto di fase migliora il contrasto dei campioni da neri a bianchi ed è utile per osservare campioni sia incolori che trasparenti.
DIC genera anche contrasto nel campione. Lo fa creando un'immagine ad alta risoluzione di una sezione ottica sottile. Ecco tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con la vostra microscopia.
Panoramica
Questo protocollo illustra i principi e le applicazioni pratiche della microscopia a contrasto di fase e a contrasto di interferenza differenziale (DIC). Queste tecniche migliorano la visualizzazione di campioni biologici trasparenti e incolori, rendendole strumenti essenziali nella ricerca biomedica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca biomedica
- Tecniche di microscopia
- Immagini ottiche
Sfondo
- La microscopia ottica è fondamentale per l'osservazione di campioni biologici.
- La microscopia a contrasto di fase migliora il contrasto per campioni trasparenti.
- La microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) fornisce immagini ad alta risoluzione di strutture fini.
- Entrambe le tecniche sono essenziali per un'analisi efficace dei campioni.
Scopo dello studio
- Mostrare l'uso della microscopia a contrasto di fase e a contrasto interferenziale differenziale (DIC).
- Spiegare l'allestimento e l'allineamento delle tecniche microscopiche.
- Evidenziare i vantaggi di questi metodi nell'osservazione di materiali biologici.
Metodi Utilizzati
- Configurazione dell'illuminazione Köhler per una distribuzione ottimale della luce.
- Utilizzo di obiettivi a contrasto di fase e anelli annulari.
- Impiego della microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC), inclusi polarizzatori e prismi divisori del fascio.
- Confronto della visibilità del campione in diverse tecniche microscopiche.
Risultati principali
- La microscopia a contrasto di fase rivela le strutture cellulari in campioni trasparenti.
- La microscopia a contrasto di interferenza differenziale migliora i dettagli fini e fornisce un effetto topografico.
- Entrambe le tecniche migliorano notevolmente la chiarezza dei campioni biologici.
- Si osservano e si spiegano artefatti come aloni nella microscopia a contrasto di fase.
Conclusioni
- Il contrasto di fase è efficace per l'osservazione di campioni incolori e trasparenti.
- La microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) offre un'immagine ad alta risoluzione di strutture fini.
- Entrambi i metodi sono preziosi per far progredire la ricerca nelle scienze biologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia a contrasto di fase e a contrasto interferenziale differenziale (DIC) consente la visualizzazione di campioni biologici trasparenti e non assorbenti alla luce, supportando flussi di lavoro di scoperta precoce in cui è richiesta un'immagine senza marcatura. Queste tecniche riducono i rischi meccanicistici rivelando dettagli strutturali e la morfologia funzionale in cellule e tessuti vivi senza fissazione o colorazione. La loro integrazione nei flussi di scoperta migliora la fiducia nella validazione degli obiettivi, permettendo l'osservazione diretta delle risposte fenotipiche e dell'architettura cellulare in condizioni prossime a quelle fisiologiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'osservazione senza marcatura di campioni trasparenti, come cellule vive e sezioni di tessuto, per valutare i cambiamenti morfologici associati alla modulazione del bersaglio.
- Valore operativo: Favorisce lo screening rapido di fenotipi cellulari senza necessità di marcatori fluorescenti o fissazione chimica, riducendo il tempo di preparazione del saggio.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nelle ipotesi sul bersaglio permettendo la visualizzazione diretta di fenotipi strutturali e funzionali in sistemi rilevanti per la malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce immagini ad alto contrasto e senza marcatura, adatte allo sviluppo di saggi fenotipici in cui la trasparenza rende poco visibili i dettagli in campo chiaro.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione delle condizioni di acquisizione grazie all'illuminazione di Köhler e all'allineamento preciso delle piastre di fase o dei prismi DIC, migliorando la riproducibilità tra diverse prove.
- Scalabilità: Compatibile con formati a piastre multipozzetto quando integrata in sistemi di microscopia automatizzati, supportando campagne di screening a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica consentendo un'immagine coerente di cellule primarie, espianti e modelli di embrioni attraverso diversi flussi di lavoro.
- De-risking meccanicistico: Rivela dettagli strutturali fini alle interfacce dei tessuti, aiutando a chiarire i meccanismi d'azione in sistemi biologici complessi.
- Sistemi rilevanti per le malattie: Applicabile a campioni spessi, inclusi sezioni di tessuto, uova ed embrioni, sostenendo la valutazione in modelli fisiologicamente complessi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La microscopia a contrasto di fase e a contrasto di interferenza differenziale funziona come tecnologia abilitante nel processo di scoperta, sostenendo la verifica delle ipotesi nella biologia iniziale, la preparazione dei saggi nella selezione e l'analisi morfologica nella ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi permettendo l'osservazione diretta delle risposte cellulari a perturbazioni in campioni trasparenti e non colorati.
- Screening: Favorisce lo sviluppo di saggi mediante imaging riproducibile e ad alto contrasto di campioni privi di marcatura, riducendo la variabilità delle letture fenotipiche.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di intensità e contrasto alle interfacce strutturali, consentendo un confronto oggettivo tra condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità fornendo una visualizzazione costante di tessuti primari ed espianti, dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità di imaging riutilizzabile tra diversi reparti, riducendo la ridondanza nell'allocazione delle risorse microscopiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica rivelando dettagli strutturali fini e caratteristiche topologiche in campioni vivi e non colorati.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione attraverso procedure definite di allineamento degli anelli di fase e dell'ottica DIC, migliorando la riproducibilità quotidiana.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione aumentando la fiducia nelle osservazioni fenotipiche, riducendo così l'abbandono tardivo dovuto a complessità biologiche inattese.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei bersagli in base a evidenze fenotipiche dirette e prive di marcatori provenienti da sistemi rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allineamento ottico, inclusa l'illuminazione di Köhler e il centratura precisa delle piastre di fase o dei prismi DIC.
- È dipendente da hardware specializzato: obiettivi per contrasto di fase con anelli di fase, anelli del condensatore, polarizzatori, prismi divisori e combinatori di fascio, e analizzatori.
- Necessita di una standardizzazione intersito dei protocolli di illuminazione e allineamento per garantire risultati coerenti tra utenti e sedi diverse.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la corrispondenza degli indici di rifrazione e lo spessore del campione, che influenzano la qualità dell'ottica a sezione DIC e gli artefatti di alone nel contrasto di fase.
- I limiti pratici includono gli artefatti di alone nel contrasto di fase che possono oscurare strutture fini, e l'effetto d'ombra direzionale in DIC, un'illusione ottica che non rappresenta la vera topografia.
