Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione
22 ottobre 2008
Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell'aria la conicità è allargato senza aumentare l'apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.
Questa procedura inizia posizionando la punta della pipetta vicino al filamento di lucidatura a un ingrandimento di 100 volte. Successivamente, accendere la pressione dell'aria e il riscaldamento. Il filamento.
La punta della pipetta si espanderà formando una punta arrotondata. Spegnere il riscaldamento per ottenere un'apertura più piccola. Spegnere nuovamente la pressione e il riscaldamento.
Ciao, sono Brandon Johnson del laboratorio della dottoressa Miriam Goodman del Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Stanford. Oggi vi mostreremo una procedura per la lucidatura a pressione delle pipette per il patch-clamp. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare canali ionici, membrane cellulari e neuroni di C. elegans.
Iniziamo. Prelevare un set di sei-dieci pipette per il patch. Consultare un esperto locale o il nostro esperimento illustrato sulla preparazione di pipette per il patch e di elettrodi affilati con un polar programmabile per ottenere assistenza.
Per iniziare la procedura, impostare la pressione dell'aria compressa a circa 40 PS.I, quindi collegare la tubazione dell'aria compressa a una valvola di controllo a quattro vie. Collegare un tratto di tubo in plastica alla valvola a quattro vie e fissare un supporto per pipette ad alta pressione all'estremità libera del tubo in plastica. Utilizzare un apparato microfusore per eseguire la lucidatura.
Utilizziamo il kit Ccpm due della LA Scientific. Questo apparato è dotato di un supporto per pipette ad alta pressione, di un filamento riscaldante in platino controllato da un pedale e di un microscopio equipaggiato con obiettivi a basso e alto ingrandimento, rispettivamente 10 volte e 100 volte. Gli obiettivi con lunga distanza di lavoro in aria sono ideali poiché è fondamentale poter osservare l'apertura della pipetta durante il protocollo.
Successivamente, verificare che la valvola di pressione sia in posizione di chiusura. Quindi inserire una pipetta nel supporto per pipetta e serrare il raccordo con le dita fino a renderlo sicuro per il laboratorio. Assicurarsi che la pipetta sia saldamente bloccata nel supporto.
In caso contrario, la pressione dell'aria farà sì che la pipetta venga espulsa dal supporto. Come passaggio facoltativo, è possibile rivestire la pipetta con un isolante idrofobo, come ad esempio cera, per ridurre la capacità e migliorare le caratteristiche di rumore. Posizionare ora la pipetta nel supporto e collocare il supporto della pipetta sulla piastra del microforno in modo che sia la punta sia il filamento per la lucidatura siano visibili a basso ingrandimento (10 volte) sul microforno.
Portare la punta a circa 50 micron dal filamento, quindi passare all'obiettivo ad alta potenza 100x; sia la punta della pipetta sia il filamento di lucidatura devono essere a fuoco e nel campo visivo. In caso contrario, regolare l'altezza del filamento. Poiché la posizione della pipetta non può essere regolata, la punta della pipetta e il filamento devono trovarsi su lati opposti del campo visivo.
Evitare di posizionare la punta della pipetta troppo vicino al filamento, poiché quest'ultimo si espande durante il riscaldamento e potrebbe urtare contro la pipetta. Una volta che la punta e il filamento sono stati posizionati correttamente, ruotare la valvola per indirizzare l'aria compressa nella pipetta e riscaldare la punta della pipetta finché la zona conica dietro la punta non inizia a gonfiarsi verso l'esterno. Interrompere il riscaldamento prima che la punta si gonfi eccessivamente.
È necessario sperimentare per determinare la distanza, il calore e il tempo appropriati per ottenere la forma desiderata. Come passaggio facoltativo, è possibile anche lucidare la punta in assenza di pressione per ridurre il diametro dell'apertura della punta. Inoltre, tenere presente che questi passaggi di lucidatura possono essere ripetuti per un aggiustamento fine.
Regolare sia la forma che le dimensioni della punta della pipetta. Al termine della lucidatura, spegnere la pressione e orientare la punta della pipetta in una direzione sicura.
Rimuovere la pipetta e riporla in una scatola di stoccaggio pulita, dove sarà protetta dalla polvere. Per la sicurezza del laboratorio, assicurarsi di spegnere la pressione prima di rimuovere la pipetta; in caso contrario, potrebbe essere espulsa dal supporto della pipetta.
Dopo la rimozione, vi abbiamo appena mostrato come lucidare le pipette a pressione per migliorare le registrazioni del patch clamp. Durante questa procedura, è importante ricordare di rivestire la bobina lucidante con vetro ad alta temperatura di fusione, al fine di ridurre al minimo il deposito di metallo vaporizzato sulle pipette. È inoltre necessario prestare attenzione quando le pipette sono esposte all'aria pressurizzata.
Assicurarsi che la pipetta sia saldamente tenuta nel supporto e spegnere l'aria prima di rimuovere la pipetta dal supporto. Ecco fatto. Grazie per aver guardato.
Un buon lavoro con la lucidatura a pressione e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questa guida descrive la modifica della forma delle micropipette di vetro mediante l'uso di calore e pressione d'aria. Il processo permette di allargare la zona conica senza aumentare l'apertura della punta, condizione essenziale per ottenere registrazioni a basso rumore in applicazioni su cellule di piccole dimensioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Preparazione di micropipette
Sfondo
- Le micropipette di vetro sono strumenti fondamentali nelle registrazioni elettrofisiologiche.
- Una resistenza della pipetta più bassa è necessaria per registrazioni di alta qualità.
- La modifica della forma può migliorare le prestazioni in diverse applicazioni.
- Questa tecnica è particolarmente vantaggiosa per le registrazioni da cellule piccole.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo per modellare micropipette di vetro.
- Ridurre la resistenza della pipetta senza aumentare l'apertura della punta.
- Migliorare la qualità delle registrazioni ottenute da cellule piccole.
Metodi Utilizzati
- Posizionare la punta della pipetta vicino a un filamento abrasivo ad alta ingrandimento.
- Applicare pressione d'aria e calore per espandere la punta della pipetta.
- Spegnere il riscaldamento per ottenere un'apertura più piccola della punta.
- Regolazioni finali spegnendo pressione e calore.
Risultati principali
- La punta della pipetta può essere rimodellata efficacemente in una forma arrotondata.
- Si ottiene una resistenza inferiore senza aumentare le dimensioni della punta.
- Questo metodo migliora la qualità della registrazione da cellule piccole.
- Illustra un approccio pratico per la modifica di micropipette.
Conclusioni
- La modellatura di micropipette di vetro è una tecnica preziosa nella ricerca neuroscientifica.
- Un design migliore delle pipette porta a una qualità superiore dei dati.
- Questo metodo può essere applicato in vari studi elettrofisiologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La lucidatura a pressione delle pipette riduce la resistenza elettrica nelle registrazioni con tecnica del patch-clamp senza alterare il diametro della punta, consentendo misurazioni più accurate dei canali ionici in popolazioni neuronali di piccole dimensioni. Questo miglioramento tecnico supporta la validazione degli bersagli nella scoperta di farmaci in neuroscienze, migliorando i rapporti segnale-rumore nei saggi elettrofisiologici. Una qualità superiore delle registrazioni aumenta l'affidabilità predittiva negli studi meccanicistici precoci dell'eccitabilità neuronale e della funzione sinaptica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione dei canali ionici in neuroni di piccolo diametro, fondamentali per lo studio del dolore neuropatico e dei bersagli dell'epilessia.
- Valore operativo: Riduce la variabilità delle registrazioni di singoli canali minimizzando il rumore indotto dalla pipetta.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce geometrie di pipetta standardizzate per pannelli di screening elettrofisiologici riproducibili.
- Valore operativo: Compatibile sia con micropipette in vetro morbido che in vetro duro, consentendo una progettazione flessibile dei saggi su diverse classi di bersagli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta le applicazioni della tecnica del perforated-patch clamp generando punte arrotondate che aumentano la formazione di bleb della membrana per perforanti antibiotici.
- Valore operativo: Estende la durata della registrazione in colture primarie di neuroni, migliorando la produttività per studi di ottimizzazione dei composti promettenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nei flussi di lavoro di scoperta precoce in cui il fenotipaggio elettrofisiologico orienta la selezione del bersaglio e il profilo dei composti attivi.
- Biologia della scoperta: Permette la validazione funzionale di bersagli canali ionici in modelli neuronali rilevanti per la malattia.
- Screening: Fornisce pipette a bassa resistenza per screening di composti ad alta fedeltà in piattaforme di patch-clamp.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative delle correnti e della conduttanza con stabilità del segnale migliorata.
- Ricerca traslazionale: Consente registrazioni longitudinali in fette acute e neuroni coltivati per la modellizzazione farmacocinetica-farmacodinamica.
- Riutilizzo aziendale: Richiede soltanto un aggiornamento del microforgiatore, rappresentando così un miglioramento scalabile ed economico dell'infrastruttura elettrofisiologica esistente.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi attraverso fenotipi elettrofisiologici più puliti.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità del saggio tra diversi siti e operatori standardizzando la geometria delle pipette.
- Valore strategico: Riduce i falsi negativi nel screening dei canali ionici minimizzando il rumore tecnico.
- Impatto sul portafoglio: Supporta le decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi preclinici mirati all'eccitabilità neuronale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso della micropipetta e nell'elettrofisiologia.
- Necessita di un microforgiatore dotato di valvola ad alta pressione, filamento riscaldante e ottiche di ingrandimento.
- Esige la standardizzazione dei parametri di pressione, calore e tempistica tra diversi utilizzatori.
- Deve tenere conto delle differenze nel tipo di vetro (calco-sodico rispetto a borosilicato) nella risposta alla lucidatura.
- È limitato dalla necessità di posizionare manualmente la punta e dall'abilità dell'operatore nel prevenire un'eccessiva espansione.
